免疫共沉淀与质谱联用检测拟南芥SIK1/Hippo互作蛋白

Hippo通路是迄今为止发现的最重要的负调控动物器官大小的信号通路之一,其核心由两对级联的激酶-脚手架蛋白复合物构成.本实验室在前期工作中首次发现了拟南芥Hippo(Hpo)的同功能基因SIK1,并建立了与Hpo-Mats对应的SIK1-MOB1模块,发现其通过促进退出细胞分裂与细胞延展,参与植物侧生器官大小的调控.为进一步探究SIK1调控器官大小的分子机制,构建了SIK1-GFP转基因株系,用GFP-Trap免疫共沉淀方法捕获与SIK1内源互作的蛋白,并进行质谱分析,获得了SIK1的候选互作蛋白.研究结果将为后续建立完整的植物Hippo信号通路打下基础.     

OSP-1启动子在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性研究

为获得能在猪卵巢颗粒细胞中高效表达的启动子,本文检测了大鼠卵巢特异性启动子OSP-1(Ovarian specific promoter)在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性。参考大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段,将其定向克隆到pc DNA3.1(+)中替代CMV启动子,并在其下游插入Zs GREEN基因片段,构建真核表达载体p OSP-1-Zs GREEN;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染不同细胞,在荧光显微镜下观察Zs GREEN表达情况,Realtime-RT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动Zs GREEN基因表达的活性。结果表明:经克隆测序,得到了465bp OSP-1启动子序列,重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光。Realtime-RT-PCR结果显示:Zs GREEN基因在卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达,在肌细胞中表达量极低;说明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,可为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。     

半乳糖代谢酶uge1基因的缺失导致裂殖酵母有丝分裂中细胞动力学的变化

uge1基因编码一种参与半乳糖代谢的酶，对细胞生长和有性繁殖等有着重要作用.该文以裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)为材料，采用激光共聚焦活细胞成像的方式首次探究了uge1基因缺失对有丝分裂的分裂期染色体、纺锤体、肌动蛋白动力学的影响.对间期微管的观察结果显示，uge1Δ细胞中含有5根微管的细胞比例增加.有丝分裂期的染色体、纺锤体动力学结果表明，uge1基因缺失会导致染色体分离异常、单极纺锤体的出现、纺锤体从形成到解聚的时间显著增加.uge1基因缺失还会影响裂殖酵母有丝分裂前期和后期纺锤体伸长.纺锤体形成类型显示，uge1Δ细胞中“棒状”纺锤体的比例显著降低，而“点状”纺锤体比例则显著增加.uge1Δ细胞的形态相较野生型细胞有显著变化，表现为长度增加及长宽比增加.肌动蛋白动力学跟踪结果表明，uge1Δ细胞中肌动蛋白束长度、从聚合到解聚的时间、停留时间和收缩时间均显著增加，而肌动蛋白从聚合到解聚的速率显著降低.以上结果表明，uge1基因缺失会导致有丝分裂染色体、纺锤体及肌动蛋白动力学缺陷.     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ（pol δ）的催化亚基．体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性．文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达. 在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中，p53表达增强; RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制． 染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性．荧光显微镜观察发现EGFPp53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质．在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中，细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平．证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达，且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响．     

P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ(polδ)的催化亚基.体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性.文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达.在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中,p53表达增强;RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制.染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性.荧光显微镜观察发现EGFP-p53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质.在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中,细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平.证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达,且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响.     

拟南芥CGP1基因启动子克隆及其GUS转基因植株的构建

前期研究发现一个功能未知基因响应植物镉胁迫,将之命名为CGP1。文章为探究植物基因CGP1的表达模式及其在响应镉胁迫中的表达变化情况,以野生型拟南芥为实验材料构建CGP1基因启动子接pART7-GUS载体及其转基因植株。通过提取野生型拟南芥的DNA,并以DNA为模板利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术克隆得到CGP1基因启动子序列,将启动子序列和GUS载体双酶切后进行连接,并转化到大肠杆菌感受态细胞中,通过测序获得构建成功的ProCGP1-GUS载体。利用浸染花序法将ProCGP1-GUS载体转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选获得ProCGP1-GUS转基因阳性植株,为研究镉胁迫下CGP1基因的功能奠定了基础。     

G9a对TMS1基因表观调控作用的研究

为探究组蛋白H3K9me2催化酶G9a对甲基化诱导静止基因1(Target of Methylation induced gene Silencing 1, TMS1)的表观调控作用, 通过染色质免疫共沉淀实验检测G9a在TMS1基因启动子区域的结合情况, 然后构建shRNA表达载体转入细胞敲低G9a, 检测TMS1启动子区域组蛋白H3K9me2修饰程度与TMS1 mRNA表达水平.研究结果显示G9a在TMS1基因启动子区域有结合, 敲低G9a后, TMS1基因启动子区域H3K9me2抑制性修饰程度降低, TMS1 mRNA表达水平上升.此结果表明G9a可能通过在TMS1基因启动子区域产生H3K9me2抑制性修饰的方式参与了TMS1基因的表观调控.     

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.     

EBNA1和Vav1共同调控Bim表达影响细胞凋亡的研究

Burkitt's淋巴瘤是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤,主要发生在非洲赤道地区,病理特征表现为颌部或腹部肿大成瘤.在我国广东地区发病率较高,目前治疗效果较差.发现在Burkitt's淋巴瘤细胞Raji中EBNA1和Vav1蛋白可以影响Bim的表达和细胞凋亡.组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)刺激Burkitt's 淋巴瘤Raji 发现促凋亡蛋白Bim表达上调.进一步实验发现病毒蛋白EBNA1和细胞蛋白Vav1的共表达可以抵消NaB对Bim启动子转录活性的影响. 因此,认为EBNA1 和Vav1 蛋白具有协同作用,共同调控组蛋白的乙酰化水平影响细胞凋亡.     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

乳腺癌Jab1蛋白调控Nov基因的表达受甲基化水平影响

为探讨癌基因Jab1在乳腺癌发生发展中的功能,首先在乳腺癌细胞MDA231中建立了慢病毒介导的Jab1基因的表达干扰系统,并通过人基因表达谱芯片分析结果以及实时定量PCR实验筛选出受Jab1调控的下游基因;此外,通过实时定量PCR以及Western blot实验证实Jab1干扰表达能降低Nov基因在转录和翻译水平表达,而且Nov启动子区域存在4个高甲基化CpG位点.进一步使用甲基转移酶抑制剂处理Jab1干扰表达细胞,发现与未使用抑制剂处理细胞相比,Nov基因的mRNA和蛋白质表达水平发生明显上调,说明Jab1基因调控Nov表达受甲基化水平的影响,提示Jab1可能是通过表观遗传学水平调控Nov基因的表达.     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human PSF and Identification of its Expression in CHO Cell Line

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况.应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFPNL真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定.将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达.成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达.     

丹参酚酸B盐对人肝星状细胞内肌细胞增强因子2的影响

以分离和培养的人肝星状细胞（H—HSC）为研究对象,观察H—HSC是否表达肌细胞增强因子2（MEF2）且与转化生长因子B1（TGF—β1）之间的关系,进一步探讨丹参酚酸B盐（SA—B）抗肝纤维化的作用机制,分离H—HSC后,用TGF—β1刺激培养的H—HSC,通过免疫印迹分析及分别转染含有MEF2启动子和Ⅰ型胶原启动子的luciferase报道基因质粒入H—HSC,检测荧光素酶活性,观察经SA—B干预后MEF2,α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）及Ⅰ型胶原表达的变化．结果显示H—HSC能够表达MEF2,且随H—HSC的活化而增加;经TGF—β1刺激的H—HSC内α—SMA的表达、Ⅰ型胶原启动子的活性和Ⅰ型胶原蛋白的生成均明显增强,同时MEF2启动子的活性和MEF2A和MEF2C的蛋白表达也明显增强;SA—B对以上这些物质的表达均有明显的抑制作用．上述结果说明MEF2参与了肝纤维化的形成,SA—B抑制H—HSC活化的作用与其抑制TGF-B1在H—HSC内的信号传导与抑制转录因子MEF2A和MEF2C的表达有关．     

虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)组蛋白H3启动子的分子克隆及在稀有(鱼句)鲫(Gobiocypris rarus)中的表达活性分析

使用高保真PCR方法从虹鳟鱼基因组中克隆得到虹鳟鱼组蛋白H3启动子.将虹鳟鱼组蛋白H3启动子插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建成重组载体pRH3EGFP-1.通过显微注射法得到转pRH3EGFP-1稀有鮈鲫.在荧光解剖镜下,可以清楚地观察到EGFP在发育到原肠胚的转pRH3EGFP-1稀有鮈鲫中表达.在稀有鮈鲫幼体鱼苗中也可以清楚地观察到EGFP在多个组织中的泛组织表达.比较CMV启动子、鲤鱼β-actin启动子、虹鳟鱼组蛋白H3启动子的EGFP表达载体pCMVEGFP,pCAEGFP,pRH3EGFP-1在稀有鮈鲫胚胎中的表达特性,结果表明pCMVEGFP最早表达,其后为pRH3EGFP-1和pCAEGFP,表达的强度依次为pCMVEGFP＞pCAEGFP＞pRH3EGFP-1.这说明虹鳟鱼组蛋白H3启动子可以作为一种有效的启动子,应用于鲤科鱼类(如稀有鮈鲫)的转基因研究.     

酿酒酵母可诱导启动子功能特性的研究

把大肥杆菌β－半乳糖苷酶基因克隆到带有ＧＡＬ１启动子的酶母诱导表达质粒ｐＹＥＳ２中，研究了酵母半乳糖诱导启动子ＧＡＬ１控制下的基因表达特性，研究表明，β－半乳糖苷酶基因的表达明显地受培养基中碳源的调节，产生的β－半乳糖苷酶可达细胞总蛋白含量的１０％左右，从而为利用可调控表达系统在酵母菌中实现外源基因较高水平表达打下了一定基础。     

虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)组蛋白H3启动子的分子克隆及在稀有

使用高保真PCR方法从虹鳟鱼基因组中克隆得到虹鳟鱼组蛋白H3启动子.将虹鳟鱼组蛋白H3启动子插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建成重组载体pRH3EGFP-1.通过显微注射法得到转pRH3EGFP-1稀有鮈鲫.在荧光解剖镜下,可以清楚地观察到EGFP在发育到原肠胚的转pRH3EGFP-1稀有鮈鲫中表达.在稀有鮈鲫幼体鱼苗中也可以清楚地观察到EGFP在多个组织中的泛组织表达.比较CMV启动子、鲤鱼β-actin启动子、虹鳟鱼组蛋白H3启动子的EGFP表达载体pCMVEGFP,pCAEGFP,pRH3EGFP-1在稀有鮈鲫胚胎中的表达特性,结果表明pCMVEGFP最早表达,其后为pRH3EGFP-1和pCAEGFP,表达的强度依次为pCMVEGFP＞pCAEGFP＞pRH3EGFP-1.这说明虹鳟鱼组蛋白H3启动子可以作为一种有效的启动子,应用于鲤科鱼类(如稀有鮈鲫)的转基因研究.     

酿酒酵母可诱导启动子功能特性的研究

把大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因克隆到带有ＧＡＬ１启动子的酵母诱导表达质粒ｐＹＥＳ２中，研究了酵母半乳糖诱导启动子ＧＡＬ１控制下的基因表达特性．研究表明，β－半乳糖苷酶基因的表达明显地受培养基中碳源的调节，产生的β－半乳糖苷酶可达细胞总蛋白含量的１０％左右，从而为利用可调控表达系统在酵母菌中实现外源基因较高水平表达打下了一定基础．     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。