三重PCR方法对猪、鸡源细菌中四环素类药物耐药基因的检测

针对GenBank上已公开的四环素类耐药基因tetA、tetC、tetM序列进行比对分析,设计特异性扩增引物,建立三重PCR法快速检测方法.结果表明,单重PCR和三重PCR的符合率为100%.应用本检测方法和传统药敏试验方法(药敏纸片法)对412猪、鸡源细菌的四环素耐药基因和表型同时进行检测.PCR检测实验结果显示,在412株待检细菌中,tetA、tetC、tetM的检出率分别为47.57%,38.35%和34.95%.药敏实验结果表明,待测细菌对四环素的耐药率最高,为95%;对多西环素的耐药率次之,为92%;对米诺环素耐药率相对最低,为84%.比较两种方法,发现其检出结果的符合率为88%.说明两种方法具有较高的一致性.本研究建立了一种猪、鸡源细菌四环素类药物耐药基因三重PCR检测方法,并进行了初步应用.     

禽畜养殖场土壤抗生素抗性基因污染的初步研究

抗生素作为禽畜疾病预防及治疗药物、生长促进剂、饲料添加剂等被广泛应用于养殖业并进入环境,造成了环境中抗性耐药菌和抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)的日益增加,从而影响人体健康和生态环境.因此,ARGs作为一种新型环境污染物已经引起了人们的广泛关注.本工作以珠海某些养殖场及周边土壤中的微生物及其ARGs为主要研究对象,采用聚合酶链反应(PCR)研究了养殖场土壤细菌DNA中9种四环素抗性基因存在和污染水平.结果表明,所研究的9种四环素抗性基因中除tetD之外,其他8种抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL、tetO、tetQ和tetX)均可检出,其中tetG的样本检出率达到94％;另外,对其中常见的4种ARGs(tet、tetC、tetG和tetX)的荧光实时定量PCR定量结果显示,在这4种基因中,以tetC在样品中的丰度最高,tetG次之.在16个土壤采样点中发现,tetC和tetG的copies/g DNA达到108量级均占50％,其他基因的copies/g DNA最低也能达到102～ 105之间,与北京某一养猪场周边土壤中抗性基因含量相当,有些甚至更为严重.     

齐口裂腹鱼维氏气单胞菌的耐药性分析

采用k-B法检测分离自齐口裂腹鱼的维氏气单胞菌对20种抗菌药物的耐药表型,用PCR法扩增维氏气单胞菌的四环素类tetA、tetC、tetM,氨基糖苷类aph(3')-lia、aac(6')-Ib、ant(3')-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa、磺胺类sull、sul2,sul3共10种耐药基因.结果显示:氟哌酸、氟苯尼考、磺胺异恶唑等1 1种药物对维氏气单胞菌有较好的抑菌效果.该菌对磺胺类和部分氨基糖苷类敏感,相关耐药基因也未检出,只有四环素类的tetA基因被检出.药敏试验结果和耐药基因检测结果基本一致,这能为维氏气单胞菌的防治和耐药机理的研究提供参考.     

禽源致病性沙门氏菌四环素耐药性基因tetC的PCR扩增及序列分析

通过对临床分离并经生化实验和血清学试验鉴定的20株禽源沙门氏菌和1株标准株C79-13进行药敏试验,结果证明:有19株有高耐药性,另外2株有低耐药性,耐药率达100%;对其四环素耐药基因tetC进行了扩增,结果获得以质粒为模板的特异性产物,与药敏试验符合率为100%;利用PCR检测四环素耐药基因tetC具有很高的敏感性和特异性,从而为禽类致病性沙门氏菌的耐药性检测提供了高效敏感的手段.     

四环素类和磺胺类双重抗生素抗性菌的特性

为了研究抗生素抗性菌、抗性基因的扩散和污染可能产生对环境和人类健康的威胁,分8 次采集城市污水处理厂（sewage treatment plants,STPs）水样,应用肉汤微量稀释法和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)方法,分离、鉴定对四环素、磺胺甲恶唑敏感菌株,分析其抗生素抗性,检测抗性基因．结果：本研究中,从某污水处理厂出水中分离22株四环素类抗性菌、26株磺胺类抗性菌,检测其对常用抗生素耐受性及抗生素浓度、抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)含量。四环素类和磺胺类双重抗性菌在5.04×102～2.51×103 CFU·mL-1（colony-forming unit,CFU）范围内,抗性菌对9 种抗生素具有抗性,最高耐受力为512mg·mL-1,其中,对氯霉素耐受能力最强,对青霉素、氨苄青霉素、头孢氨苄、环丙沙星、庆大霉素、阿奇霉素耐受力次之,对利福平耐受力最弱;检测到双重抗性基因,其中tet W和sul1的含量较高. 结果表明：城市污水处理厂的四环素类和磺胺类抗生素含量较高,存在双重抗性菌、抗性基因。     

河南省某小型猪场废水中细菌耐药性调查

由于我国畜牧养殖业中抗生素长期使用,导致了养殖废水中的抗生素耐药菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)的大量出现以及抗生素抗性基因(antibiotic resistant gene, ARG)的污染,给周边水源以及生态环境带来了巨大的风险.为调查河南区域小型养猪场废水中细菌的耐药性和抗生素抗性基因存在情况,对某小型猪场8个取样点的污水及底泥样品进行检测.利用抗生素药敏试验调查了废水中细菌的耐药性及PCR扩增技术检测抗生素抗性基因的存在情况.结果表明:(1)母猪舍、仔猪舍、育肥舍、妊娠舍和产房5个采样点的废水中细菌的耐药率较高,在经过处理后污水池和沉淀池废水中细菌耐药率显著下降,但与自然环境相比依然较高;(2)四环素类、磺胺类及氨基糖苷类抗生素抗性基因在猪场和生活区细菌中均有较高的检出率,可能在环境中发生迁移,进入附近生活水源区.该研究的调查数据为规范小型养猪场中抗生素的合理使用和进一步展开小规模养猪场中抗生素抗性细菌和抗性基因的污染研究提供了参考.     

湘江四环素及抗性基因含量特征及其季节变化

采用高效液相色谱质谱法分析了湘江长沙河段水体及底泥中4种常见四环素类抗生素的含量特征及其季节变化,并采用实时荧光定量PCR研究了该水域相应的5种代表性抗生素抗性基因(tet A,tet C,tet G,tet M和tet X)的存在及丰度.结果表明,水体中四环素类抗生素的质量浓度均值在16.23~496.73ng·L-1之间,底泥中四环素类抗生素的质量分数为347.77~3 829.75ng·kg-1,易受季节变化影响.5种目标抗性基因在所有样品中均有检出,其中tet A和tet C的绝对拷贝数及相对丰度较高,为湘江长沙河段的优势抗性基因.相关性分析表明:冬季水体中的tet A和tet C含量与底泥中的含量显著相关,几种目标抗生素与抗性基因之间并不存在明显线性关系.     

从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究

目的 研究从腹泻实验兔分离到的大肠埃希菌的生物学特性。方法 对一株从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌的遗传谱系、抗生素敏感性、消毒液敏感性以及细菌携带的耐药基因和毒力基因进行较为全面的研究。结果 该大肠埃希菌属于B1型遗传谱系，携带毒力基因eaeA,属于肠致病性大肠埃希菌。对常用的5种消毒液敏感，对于青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、米诺霉素、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、复方新诺明等11种抗生素耐药，携带aadA1,gyrA,sul1和tetA等4个抗生素耐药基因。结论 从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌为一株B1型遗传谱系的肠致病性大肠埃希菌，具有多重耐药性，对常用的消毒剂均敏感。     

规模化鸡场粪样和苍蝇产CMY-2大肠杆菌中耐药基因与毒力基因调查及其共转移研究

为了解全国20家规模化鸡场粪样和苍蝇产CMY-2大肠杆菌中耐药基因与毒力基因的流行现状及其共转移情况,对2013-2015年间分离自粪样和苍蝇中的549株大肠杆菌,采用聚合酶链反应（PCR）方法筛选出blaCMY-2阳性菌株;脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析blaCMY-2阳性菌株的遗传进化关系;K-B纸片法检测阳性菌株对13种抗菌药物的耐药性;利用PCR技术检测19种相关耐药基因以及14种毒力基因;接合转移试验和质粒复制子分型研究耐药基因及毒力基因的传播方式。结果,33株大肠杆菌呈CMY-2阳性,阳性率为6.0 %,且均表现为多重耐药;检测到15种耐药基因（blaTEM-1、blaCTX-M-55、blaOXA-1、qnrBDS、aac(6’)-Ib-cr、oqxA、tetA、tetC、sul1、sul2、sul3、rmtB和flor）和4种毒力基因（iutA、traT、fyuA和VagC）;33株携带blaCMY-2基因菌株中有21株接合转移成功,blaCMY-2基因可通过lncA/C或lncI1质粒与耐药基因（blaTEM-1、blaCTX-M-55、tetA或sul2）和（或）毒力基因（traT或VagC）共同转移。本研究阐明了规模化鸡场产CMY-2大肠杆菌携带耐药基因与毒力基因的情况,证实了细菌中质粒介导的耐药与毒力的共转移,为耐药性传播及疾病防控提供了参考。     

成都市武侯区动物性食品源大肠杆菌耐药表型的检测与分析

采用K-B纸片扩散法对36株从2011年到2013年期间分离的携带有毒力基因的动物性食品源大肠杆菌进行氨苄西林、四环素、头孢曲松、环丙沙星等12种抗菌药物的药敏试验.结果表明受试菌株对头孢噻肟、四环素、氨苄西林、诺氟沙星、阿米卡星、氯霉素和环丙沙星有较高耐药率,分别为88.89%、77.78%、69.44%、61.11%、58.33%、47.22%和47.22%.大部分受试菌株普遍存在多重耐药性,耐药谱集中在3耐、5耐、6耐和7耐,特别是5耐以上的耐药菌株占到72.1%.菌株对氯霉素、庆大霉素、四环素和氨苄西林的耐药性随时间推移有上升趋势,并推测携带eae A毒力基因型的大肠杆菌与AMK、CTX、AZT、TET和AMP耐药性之间具有一定关联性,携带aggR毒力基因型的大肠杆菌与TET、CTX、NOR、AMP和CIP耐药性之间具有一定关联性.研究结果揭示了成都市动物性食品源大肠杆菌耐药性普遍和严重,为成都市大肠杆菌耐药性的安全评价提供依据.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

Chemiluminescence Determination of Tetracycline and Oxytetracycline in Pharmaceutical Preparations Using Ru(bipy)32+-Cerium(Ⅳ) System

A new chemiluminescence (CL) method for the determination of tetracycline and oxytetracycline is developed, based on the CL reaction of tetracycline and oxytetracycline with Ru(bipy)32+ and Ce (Ⅳ). In sulfuric acid medium, the CL emission is generated upon continuous oxidation of Ru(bipy)32+ by cerium (Ⅳ).The emission intensity is greatly enhanced when tetracycline and oxytetracycline are introduced into the reaction system after acid degradation. Under the optimum conditions, the calibration curves are linear over therange of 8. 0× 10-8～4. 0× 10-6 mol/L for tetracycline and of 2. 0× 10-7～4. 0× 10-5 mol/L for oxytetracycline, with the detection limits are 4. 2 × 10-8 mol/L for tetracycline and 1.5 × 10-7 mol/L for oxytetracydine, respectively. The proposed method was used for the determination of tetracycline and oxytetracycline in pharmaceutical formulations with good results.     

耐磨耐蚀耐结垢节能型管道

以可靠的资料和现场试验结果为依据,介绍我国耐磨管道的新进展,即从单纯的耐磨管道向具有复合功能的耐磨耐蚀耐结垢的节能型管道发展.着重概述了我国超高分子量聚乙烯管道应用的新成就.     

Fluorescence determination of tetracycline by Eu (III)/TOPO/TC system

The fluorescence intensity of the europium (III)-tetracycline (TC) complex can be greatly increased by TOPO, TBP, TTA and surfactans, among which TOPO showed the greatest enhancement. The formation of ternary complex was proposed to be responsible for the fluorescence enhancement. The Eu (III)-TOPO-TC system can be applied to the determination of trace amounts of tetracycline in urinous sample; the maximum fluorescence intensity was obtained in the pH range of 8.2∼9.5 with excitation and emission wave-lengths at 396 nm and 616 nm, respectively. The linear range for tetracycline is 6.0×10⁻⁹−5.0×10⁻⁷ mol·L⁻¹. The detection limit is 2.0×10⁻⁹ mol·L⁻¹(SNR=3). Experimental conditions and the mechanism of the enhancement effect are discussed. Supported by National Natural Science Foundation of China Huang Chunbao: born in 1958, Associate professor     

四环素人工抗原的合成与鉴定

采用碳二亚胺法将四环素半抗原与载体蛋白BSA连接制备人工免疫抗原,并用同样方法将四环素与载体蛋白OVA连接制备人工包被抗原.经紫外扫描分析和动物免疫试验证实人工抗原合成成功,为检测试剂盒的研制奠定了基础.     

超临界反溶剂过程制备四环素超细微粒

超临界反溶剂过程是近年来提出的一种制备纳微米粉体材料的新方法．实验以乙醇为有机溶剂,CO2为反溶剂,利用连续式超临界反溶剂过程制备四环素超细微粒．研究了操作压力、温度、浓度、喷嘴内径等操作参数对制备的四环素超细微粒形态、粒径及粒径分布的影响．实验结果表明：采用乙醇作为有机溶剂,在压力15．0MPa、温度35℃、溶液浓度5mg／mL及喷嘴内径75μm实验条件下可得到较理想的实验结果,制备出的四环素超细微粒平均直径为20～40nm．     

四环素产生菌15^#菌株的选育

报道了采用放线菌菌丝准性杂交的方法选育出四环素产生菌１５￣＃新菌株。研究结果表明：新菌株与亲本相比较，具有良好的耐低溶解氧浓度的特点，即在相同条件下，增加摇瓶装量，新菌株发酵单位高出对照１７％。     

特种Al Si Cu耐热铸铁的研究

特种 Al、Si、Cu 耐热铸铁通过加入少量稀土、Ti、Mo 合金元素后并采用合理的退火工艺,耐热性和耐磨性都得到提高.耐热温度可达900～1000℃.HRC 可达40以上.可用来代替高铬耐热铸铁、耐热钢及其它昂贵的耐热合金.