鲢(Hypophthalmichthys molitrix)IL-10基因的克隆及表达分析

白细胞介素10(IL-10)是一种作用广泛的抗炎细胞因子,主要功能是限制和最终终止炎症反应.用RACE(rapid amplification of cDNA ends)-PCR方法扩增出鲢白细胞介素10(IL-10)的cDNA,其全长为1248nt,包含5'非编码区156nt,3'非编码区552nt,开放阅读框540nt.鲢IL-10的开放阅读框编码179个氨基酸,其中包含构成两对二硫键的4个保守半胱氨酸.RT-PCR结果显示鲢IL-10mRNA主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达.将鲢IL-10完整开放阅读框克隆到原核融合表达载体pET-32a-c(+)上,转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)内进行表达,经SDS-PAGE电泳后显示重组融合蛋白在分子量约39 ku处有明显表达带,与预期分子量大小一致,且主要以不可溶的包涵体形式存在.变性条件下利用His·Bind树脂成功纯化了融合蛋白,将其免疫家兔,获得兔多克隆抗鲢IL-10抗体,Western blot检测到兔多克隆抗鲢IL-10抗体可有效地与重组蛋白结合.这些结果为进一步研究IL-10的功能奠定了基础.     

甲氰菊酯对白鲢（Hypophthalmichthys molitrix）鳃组织病理学研究

为探讨甲氰菊酯对鱼类的致毒机理，将白鲢暴露于不同浓度的甲氰菊酯溶液中，结果可见，鳃组织出现鳃小叶增生、扭曲，鳃小叶末端膨大，上皮细胞坏死脱落等现象，而且鳃组织的损伤程度与暴露剂量、时间正相关，并与鳃匀浆中的Ｎａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ活力及鱼群死亡率有明显的相关关系．因此认为鳃组织病理学损伤作用是甲氰菊酯对白鲢高毒的重要原因之一．     

草鱼生长激素基因的克隆及原核表达研究

应用RT-PCR技术从草鱼脑垂体总RNA中克隆草鱼生长激素cDNA(cGH)，全长669bp，含开放阅读框633bp，编码210个氨基酸，分子量为23．6kDa，等电点为6．28；与已报道的草鱼GH有12个碱基、3个氨基酸残基的差异，同源性为98％．将草鱼cDNA定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，构建了重组草鱼GH基因质粒pGEX-GcGH，经IPTG诱导，pGEX-GcGH在大肠杆菌中可表达49．6kDa的融合蛋白．     

小鼠OB基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织中扩增了OB基因,并利用定向克隆技术克隆至原核表达载体pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot检测.表达产物利用亲和层析技术进行纯化.结果显示:表达的带有his标签的小鼠leptin融合蛋白,分子量约为20 ku.0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导2.5 h时,leptin融合蛋白的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上.表达产物经过纯化,纯度可达90%以上.Western-blot杂交显示,小鼠leptin融合蛋白有很强的抗原特异性.     

牛蛙生长激素基因cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

以成体牛蛙脑垂体总RNA为模板进行RT-PCR,克隆到牛蛙生长激素基因(bullfrog growth hormone, bfGH)cDNA编码序列,其长度为651 bp,编码的前体GH蛋白序列经BLAST分析,与已报道的牛蛙GH蛋白质序列AAB24792、AAB19428、CAA31038的同源性分别为98.1%、96.3%、95.3%,其在Genbank的登录号为AY251538;将bfGH亚克隆到原核表达载体pGEX1-λt构建成牛蛙GH原核表达载体VGBfGH,转化BL21（DE3）E.coli得     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列.同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895).RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势.推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用.     

人Rab蛋白cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的Rab cDNA,全长920bp,以编码213个氨基酸残基,该蛋白预测的分子质量为24567u,等电点7．34,经同源比较,该cDNA与GenBank数据库中登录号为X14964的Rab蛋白有83％的相似性和76％的相同性,将该cDNA克隆到经改造的PBV220表达质粒,转化DH5a菌株诱导表达出该蛋白,取24种不同组织的总cDNA各100ng,用该基因序列设计引物作PCR,结果在胎肝组织中检测到有明显条带,表明该Rab基因相对在胎肝有高表达。     

波纹唇鱼神经肽Y基因的克隆及原核表达

以波纹唇鱼为实验对象,采用同源基因克隆技术和RACE技术得到神经肽Y基因的cDNA全长序列.波纹唇鱼npy的cDNA全长序列为645 bp,包含59 bp的5'UTR、300 bp的ORF和286 bp的3'UTR.分子进化的比对分析表明,波纹唇鱼NPY前体与斜带石斑鱼和锯隆头鱼的亲缘关系最近.波纹唇鱼ORF编码99个氨基酸,NPY前体多肽包括:信号肽、成熟肽、Gly-Lys-Arg翻译后加工位点和羧基末端侧翼肽段(CPON).该NPY前体的预测分子质量为11.27 kD,理论等电点为5.51.采用pET-32a(+)原核表达系统构建波纹唇鱼npy基因的原核表达重组子pET-32a(+)-NPY,并获得重组菌株.对重组蛋白表达菌株进行培养条件优化,结果表明:该菌株在30℃,0.6 mmol/L IPTG,培养时间8 h的条件下,重组蛋白的表达效率最高.     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

 通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列。同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895)。RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势。推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。     

巨尾桉铜分子伴侣EuCCS基因的克隆及表达分析

以巨尾桉为研究对象,克隆得到巨尾桉铜分子伴侣(CCS)基因(GenBank注册号为KJ755351.1),生物信息学分析表明:EuCCS蛋白定位于叶绿体,与龙眼同源基因的一致性达到99%.巨尾桉CCS的原核表达载体pET-EuCCS在大肠杆菌细胞内可以稳定表达,超氧化物歧化酶(SOD)活检测结果表明:转化菌株的SOD酶活性比对照菌株高,说明外源基因EuCCS具有生物学活性.利用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术分析CCS在巨尾桉中的表达特性,结果表明:在植株生长旺盛的部位,CCS表达量较大,如植株幼叶,随植株叶片慢慢衰老,CCS的表达量也随之下降;在组培苗中,叶片的CCS表达量最大,其次是茎.     

小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达

根据GenBank报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特异性引物对PPRV疫苗株F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:F基因ORF全长1641 bp,编码546个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1~18位氨基酸构成信号肽序列,第488~510氨基酸为跨膜区。构建原核表达载体pETF1和pETF2,转化E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blotting的分析结果表明,F1和F2基因在大肠杆菌中均获得了表达,且均具有良好的反应原性。用Ni-NTA试剂盒纯化F1和F2重组蛋白,为研发检测PPRV特异性抗体的诊断试剂奠定了基础。     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒蛋白基因VirD1的克隆及原核表达

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1蛋白表现拓扑异构酶活性,能解除T-DNA边界处25bp重复序列的超螺旋状态,使外源基因的插入成为可能.本实验以C58菌株为模板,设计了一对含有BamHI和XhoI酶切位点的引物,成功克隆了VirD1基因,并构建了原核表达载体pET30a-VirD1,将其在宿主菌BL21中获得了表达,为将来构建含有VirD1基因的植物表达载体并协助目的基因转化奠定基础.     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

斑马鱼3种胰蛋白酶原基因的克隆、序列分析及组织表达

 胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶类超家族成员之一,在动物蛋白消化中起着重要作用。为深入研究胰蛋白酶在鱼类中的蛋白结构和生理功能,利用RT-PCR和RACE方法,成功获得了斑马鱼3种胰蛋白酶原cDNA序列(zftry1a、zftry1b和zftry2)。结果表明,zftry1a和zftry1b均有242个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸(LDDDK)的激活肽。zftry2由247个氨基酸残基组成,其中包括15个氨基酸的信号肽和9个氨基酸(APLGDDDDK)的激活肽。氨基酸序列比对结果显示,三者具备胰蛋白酶原的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸(His-57、Asp-102和Ser-195),12个半胱氨酸,位于底物结合口袋底部Asp-189和口袋开口处的Gly-216、Gly-226等。进化树结果显示,斑马鱼zftry1a和zftry1b属于group I,为阴离子胰蛋白酶原;斑马鱼zftry2属于group II,为阳离子型胰蛋白酶原。RT-PCR结果显示,三者组织分布模式类似,且在肠中有最高表达量。这些结果为研究鱼类胰蛋白酶原的基因进化和功能以及进一步探讨鱼类消化生理的分子机制奠定了基础。     

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究

以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.     

斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

青稞脱水素基因dhn4的克隆与原核表达

用RT-PCR的方法从重要的高原作物青稞(Hordeum vulgare L.vat.nudum Hook.f.)中克隆到了脱水素基因dhn4,其编码区长为678 bp,所编码的蛋白质DHN4为YSK2型脱水素.经预测,该蛋白二级结构易形成α-螺旋,并无固定的三级结构.将dhn4基因cDNA编码区定向克隆到载体PEW30-c上,获得了重组质粒PET-dhn4,该重组质粒再转化到大肠杆菌BL21茵株,37℃经1.5 mmol/L IPTG诱导获得了大量分子量约为35 kD的融合蛋白.然后用亲和层析的方法对该蛋白进行纯化,得到了纯化的脱水素DHN4蛋白.     

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^-1 IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni²⁺亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320 000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致...     

枝状枝孢霉MD2的Unigene A03231的克隆及原核表达分析

为研究真菌紫杉醇合成相关基因的功能,从产紫杉醇真菌枝状枝孢霉MD2中克隆了Unigene A03231的DNA和c DNA全长序列(918 bp).结果表明:该基因不含内含子,其编码产物含305个氨基酸,与短链脱氢酶/还原酶一致性为64%,预测蛋白分子量为33071.5 Da,不存在信号肽,含有2个跨膜结构.Unigene A03231以单拷贝形式存在于基因组,在0~30 h内其表达水平随茉莉酸甲酯诱导表现为先升高后降低.构建了该基因的原核表达菌株,初步优化了其在大肠杆菌BL21中的诱导表达条件为:诱导温度28℃,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间8 h.为深入分析该基因的催化功能奠定了基础.     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.