大鼠csrp2基因真核表达质粒的构建及表达

获得大鼠csrp2,基因片段并构建真核表达载体.RT-PCR法从大鼠心脏组织中提取总 DNA,并扩增出相应大小的csrp2 DNA片段,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染Cos-7细胞,分别以RT-PCR 方法检测mRN-表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pcDNA 3.1(-)-csrp2,RTPCR结果证明csrp2,可在cos-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有CRP2蛋白的细胞着染.成功构建了大鼠csrp2基因的真核表达载体pcDNA 3.1(-)-csrp2,csrp2,基因可以在Cos-7细胞中表达.     

人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究

构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒pcDNA3.1( )/tPA,并研究其有无生物学活性.用RT-PCR法从人心脏组织中克隆tPA基因并将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,对pcDNA3.1( )/tPA进行酶切鉴定和测序.脂质体介导pcDNA3.1( )/tPA转染血管平滑肌细胞,分别用Nothern Blot和斑点印迹法从mRNA和蛋白质水平检测tPA的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性.成功克隆了人tPA基因并构建了pcDNA3.1( )/tPA真核表达质粒,pcDNA3.1( )/tPA转染VSMC后,tPA mRNA和蛋白质表达增加,所表达的tPA蛋白质具有纤溶活性.     

pEGFP-N3-t-PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物（t—PA）基因并构建一种能高效、安全表达t—PA的pEGFP—N3-t—PA真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础．方法采用高效Trizol试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA,RT—PCR获得t—PAcDNA,并将真核表达质粒pEGFP—N3和t—PA基因片段分别双酶切,将回收的pEGFP—N3大片段（4．7kb）与t—PA基因片段（1．1kb）重组．对pEGFP—N3-t—PA质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定．脂质体介导pEGFP—N3-t—PA转染成纤维细胞（NIn313）,并用RT—PCR法从mRNA水平检测t—PA的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NH 3T3细胞中的表达．结果成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t—PA基因,并构建了以pEGFP—N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t—PA．结论含t—PA基因真核表达质粒构建成功．     

小鼠白细胞介素-18的克隆及真核表达质粒的构建

克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）,并与真核表达质粒pcDNA3.1/HisB重组,构建真核表达重组质粒.采用RT-PCR,从小鼠肝细胞中扩增IL-18的全长cDNA.经Hind Ⅲ,EcoR Ⅰ双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pcDNA3.1/HisB.通过酶切、PCR及测序对重组体进行鉴定.经鉴定,重组质粒构建正确,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/mIL-18,为下一步进行IL-18的功能研究奠定了基础.     

pVT102U/α-bgln重组真核表达质粒的构建和鉴定

构建重组真核表达质粒pVT102U/α-bgln使之可以在酿酒酵母中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以含有从黑曲霉中获得的编码β-葡萄糖苷酶(bgln)成熟肽的cDNA的克隆质粒pMD19T-bgln为模板,用PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln),利用真核表达载体pVT102U/α构建pVT102U/α-bgln重组质粒,PCR结果显示扩增片段约2.6 kb,与预期相同.用酶切电泳验证重组结果的正确性,重组质粒酶切后显示其大小约10 kb,大小及酶切图谱与预期相同.测序检测质粒重组后序列情况,经测序发现插入片段两端序列无改变,且读码框正确.pVT102U/α-bgln质粒构建成功.     

人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达

将带有哺乳动物细胞信号肽的人白细胞介素-6(hIL-6)基因片段构建到大肠杆茵-酵母细胞穿梭型质粒pYES2中，获得表达质粒pYES2-hIL-6。另外，将表达质粒pYES2-hIL-6转化到酿酒酵母细胞DBY747中，并将获得的转化子在含2％乳糖的YP培养基中培养到OD600=1．0左右，后用2％的半乳糖进行了诱导表达。结果发现，在培养上清中发现人白介素-6的分泌。     

EGFR基因C端结构域真核表达载体的构建

构建EGFR基因C端结构域的真核表达载体.应用PCR技术,从含EGFR基因C端结构域的大肠杆菌DH 5α中扩增其序列,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,经酶切及测序进行验证.PCR扩增片段与预期结果相符,真核表达载体构建成功,测序结果与GenBank公布的基因一致.成功地构建了EGFR基因C端两个结构域的真核表达载体.     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒PY-α的构建

利用分子生物学方法，以含人结核杆菌热休克蛋白（HSP）70基因全长序列的质粒pMT-70为模板，扩增出hsp70启动子，将其定向克隆于pUC-19，构建成重组质粒pY6013；然后以重组质粒pIJK-1为模板，扩增出分枝杆菌α信号肽基因并将其克隆到pY6013闰中hsp70启动子的下游，得到了大肠杆菌－分枝杆菌表达质粒pY-α。     

人Kai-1基因真核表达载体的构建及其体外表达

克隆人Kai-1基因,构建其真核表达载体,并在体外细胞系中进行表达验证。提取人正常肝细胞系HL7702的总RNA,通过RT-PCR其反转录为c DNA;以该c DNA为模板,通过PCR扩增出Kai-1基因的编码区,将该目的片段纯化后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1myc-his(-)中,利用菌落PCR及DNA测序分别对Kai-1基因编码区的大小及序列进行鉴定。将所构建的重组质粒通过脂质体瞬时转染Hela细胞,48 h后裂解细胞,利用Western blot检测有无目的蛋白的表达。测序证实所克隆的Kai-1编码区c DNA正确地插入pc DNA3.1myc-his(-)中,经Western blot检测证实其在Hela细胞中得到表达。成功克隆了人Kai-1 c DNA,构建了其真核表达载体,并在Hela细胞中得到有效表达,为进一步研究Kai-1的功能奠定了基础。     

c-Src结构域真核表达载体的构建及鉴定

通过聚合酶链式反应(PCR),将c-Src的三个结构域SH3、SH2和KD分别定向克隆至C端带有HA蛋白标签序列的真核表达载体pcDNA3中.经HindIII和XbaI双酶切分析和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞48 h,蛋白免疫印迹法可以检测到细胞内SH3、SH2和KD的表达,证明重组表达质粒pcDNA3-SH2、pcDNA3-SH3和pcDNA3-KD构建成功,为进一步研究Src激酶在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

IL-21/4-IgG4融合基因的真核表达

利用新型细胞因子IL-21的变异体IL-21/4与IgG4构成融合基因IL-21/4-IgG4. 将构建好的融合基因载体poptivec- IL-21/4-IgG4转染到中华仓鼠卵巢细胞中,成功并稳定表达了IL-21/4-IgG4融合蛋白.     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达

目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒.方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA- pIRES-BCR/ABL重组质粒.将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况, SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达.结果:成功扩增出BCR/ABL和 SEA基因片段;双酶切鉴定BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,测序证实完全正确;将重组质粒转染K293细胞后,经 RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR/ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR/ABL和SEA蛋白.结论:成功构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,可在真核细胞中正常转录并表达BCR/ABL和SEA蛋白.