大鼠csrp2基因真核表达质粒的构建及表达

获得大鼠csrp2,基因片段并构建真核表达载体.RT-PCR法从大鼠心脏组织中提取总 DNA,并扩增出相应大小的csrp2 DNA片段,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染Cos-7细胞,分别以RT-PCR 方法检测mRN-表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pcDNA 3.1(-)-csrp2,RTPCR结果证明csrp2,可在cos-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有CRP2蛋白的细胞着染.成功构建了大鼠csrp2基因的真核表达载体pcDNA 3.1(-)-csrp2,csrp2,基因可以在Cos-7细胞中表达.     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建

作者用DNA重组技术,构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4,它是以大肠杆菌(Es-cherichiacoli)质粒载体pUC18为骨架,与来自穿梭质粒表达载体pREP9含有革兰氏阳性菌复制起点(on     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建

目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。     

hTR基因反义表达质粒构建及序列分析

从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增得到的 h TR基因的 DNA序列与所发表的序列完全一致 .构建的反义表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 p LNCX的克隆位点上 ,构成了 h TR基因的反义表达质粒     

ERF类转录因子OPBP1基因重组质粒的构建及蛋白质表达

探讨了OPBP1基因的蛋白质表达方法.利用DNA重组技术,将pGEM-OPBP1和pET-32a分别进行SalⅠ和NotⅠ双酶切,连接,获得了重组质粒pET-OPBPI质粒.IPTG诱导其蛋白质表达.获得了高表达量的OPBP1融合蛋白.     

结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达质粒的构建及表达

构建结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达载体.PCR扩增Rv2450基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA-Rv2450,RT-PCR结果证明Rv2450可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv2450蛋白的细胞着染.成功构建了结核分枝杆菌Rv2450基因的真核表达载体pCDNA-Rv2450,Rv2450基因可以在P815细胞中表达.     

pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射抗肿瘤效应的实验研究

目的研究pEgr-Endostatin辐射诱导肿瘤的表达特性及其抗肿瘤作用,为提高临床肿瘤放疗疗效提供实验证据.方法 Western blotting法检测pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射诱导黑色素瘤B16细胞蛋白表达;建立动物模型,用ELISA法检测不同处理组Endostatin的剂量水平,比较不同处理方式的差异.结果 Western blotting法检测结果显示:重组质粒转染的黑色素瘤B16细胞上清中均有Endostatin蛋白表达,而未转染重组质粒的B16细胞和转染空质粒的B16细胞上清中未见Endostatin蛋白表达.ELISA法检测结果表明:体外接受2~10 Gy X射线照射,Endostatin表达水平明显增加,且照射剂量为4 Gy时Endostatin的表达水平最高.2 Gy照射8~72 h后,Endostatin表达水平与假照射组比较明显增加,在48 h时Endostatin表达水平最高.动物实验表明:荷瘤+25 Gy照射组、荷瘤+pEgr-Endostatin照射组、荷瘤+pc DNA3.1+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin+25Gy照射组肿瘤生长率显著低于单纯荷瘤组(P0.05#0.01),荷瘤+pEgr-Endostatin+25 Gy照射组亦明显低于荷瘤+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin组(P0.05#0.01).结论 pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射能使Endostatin蛋白表达增加,从而抑制血管内皮细胞生长、发挥抗肿瘤作用.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。     

泛素与EB病毒核抗原1的融合表达载体的构建及表达

成功构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)氨基端融合有泛素(ub iqu itin,Ub)的真核表达质粒pC I-Ub-EBNA1。间接免疫荧光分析表明,该重组质粒瞬时转染HeLa细胞后能有效表达。     

HCV非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21细胞中的表达

通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b,并且NS3/4A蛋白和NS5B蛋白得到特异性表达,为下一步建立HCV RdRp活性的细胞评价系统和动物模型评价系统奠定了实验和理论基础。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

结核分枝杆菌mpt64基因真核表达载体的构建及表达

构建结核分枝杆菌分泌蛋白mpt64基因真核表达载体。通过PCR法从MTBH37Rv株基因组中扩增mpt64基因,插入pGEM-T-easy载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后,以Lipo-fectamine2000转染COS-7细胞后,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。构建了真核表达载体pcDNA-mpt64,RT-PCR结果证明mpt64基因可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,有表达mpt64蛋白的细胞着染。结果表明,构建结核分枝杆菌mpt64基因的真核表达载体pcDNA-mpt64成功,mpt64基因可以在COS-7细胞中表达。     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。     

促血管生成素载体构建及在癌细胞中的表达

[目的]构建人促血管生成素-2(Ang-2)基因的重组peDNA3真核表达载体,为进一步研究Ang-2在肿瘤血管生长上的作用奠定基础．[方法]从人胎盘组织中提取Ang-2总RNA,经过RT-PCR扩增、TA克隆、酶切鉴定、DNA序列分析后,将纯化的Ang-2基因克隆到pcDNA3真核表达载体上,转染Hela细胞,应用RT-PCR方法鉴定细胞表达的mRNA．[结果]RT-PCR得到的产物经DNA测序,与Genebank中人Ang-2eDNA序列一致;构建人Ang-2真核表达载体,转染人Hela细胞,细胞表达Ang-2目的基因mRNA。[结论]成功构建人Ang-2基因真核表达载体pcDNA3-Ang-2．     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

结核分枝杆菌mpt64基因稳定表达细胞系的建立

为建立稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白MTP64的P815细胞系,将mpt64基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),构建mpt64真核表达载体.重组质粒酶切鉴定正确后,以Lipofectamine2000转染P815细胞,通过G418筛选后,得到阳性克隆,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达,间接免疫荧光和Western-blot检测目的蛋白的表达.表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的真核表达载体转染细胞后,RT-PCR可扩增出目的基因片段,转染细胞间接免疫荧光检测阳性,Western-blot检测在约26 kDa处有特异显色条带,证实转染细胞表达目的基因.成功地建立mpt64稳定表达细胞系,为进一步结核疫苗评价奠定一定基础.