查尔酮合酶基因的克隆及双元载体的构建

以中国水仙为材料，利用RT-PCR方法克隆查尔酮合酶基因(CHS)的cDNA，核酸序列分析表明，该基因的编码区长1167bp，编码389个氨基酸，通过进一步的中间克隆，将CHS连上CaMV35s启动子和Tnos终止子。进一步将重组片段插入植物表达载体pCAMBIA1301,PCR及测序结果都证明植物双元表达载体p1301BΩＣ构建获得成功。为进一步在植物中表达CHS奠定了基础。     

水稻petH基因启动子的克隆及其转化载体的构建

以水稻幼嫩叶片为材料,提取基因组DNA;根据GenBank公布的该启动子序列设计引物,克隆了水稻的petH启动子,并构建了用于植物转化的双元载体p1391Z-OsR-petH-pro,为进一步研究该启动子在植物体中表达调控模式提供了试验条件。     

水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A(ChsA)的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

苦瓜(Momordica Charantia L.) MADS-box基因BAG启动子的克隆分析及表达载体的构建

作者提取苦瓜基因组总DNA，构建了DNA步移文库，并根据已克隆并公布的苦瓜MADS-box基因BAG的基因序列设计引物，通过染色体步移技术克隆出BAG基因起始密码子上游调控序列BAGP．对BAGP的鉴定和分析表明其具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BAG基因的表达具有一定的作用．为鉴定BAG基因的基本启动子元件。将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BAGP中得到3个大小不等两端带有HindⅢ,BamHⅠ酶切位点的片段BAGPl，BAGP2和BAGP3，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达裁体BAGPVl，BAGPV2和BAGPV3．     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

水稻花药特异表达基因启动子的扩增及克隆

采用ＤＮＡ聚合酶链式反应扩增技术，以水稻黄化苗总ＤＮＡ为模板成功地扩增到水稻花约特异表达基因扇动２子Ｏｓｇ６Ｂ的７７０ｂｐ和９６０ｂｐ两个片段Ｏｓｇ６Ｂａ和Ｏｓｇ６Ｂｂ。并将其克隆到ｐＵＣ１８上形成完整的Ｏｓｇ６Ｂ，这为通过基因工程方法进行水稻杂种优势利用奠定了基础。     

豌豆凝集素基因的克隆与植物表达载体的构建

为研究凝集紊基因转化非豆科植物后对根瘤菌的识别作用,设计特异引物扩增出豌豆凝集紊基因,并对基因序列进行比对分析．将豌豆凝集紊基因克隆到载体pVCT2020中,获得植物表达载体pVCT—PsL．该载体可用于转化烟草等非豆科植物．     

大肠杆菌基因启动子探针型载体的构建

利用ＰＣＲ技术将ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中的多克隆位点区（ＭＣＳ）及旁侧序列分别进行扩增,然后将扩增产物插入到已除去ＬａｃＺα基因的ｐＵＣ１８中,获得三个中间载体ｐＳＵＧＶ１,ｐＳＧＶ２和ｐＳＵＧＶ３,最后将ｐＳＵＰＶ２中无表达活性的新霉素磷酸转移酶Ⅰ（ＮＰＴⅠ）基因分别插入到三个中间载体的ＭＣＳ中,构建成功大肠肝菌基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,ｐＳＵＰＶ５和ｐＳＵＰＶ６．     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建

利用PCR法直接从自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因,再将PCR产物重组于乳酸菌表达载体pMG36e,构建phyA基因的新型表达载体pMG36e-phyA.以黑曲霉F246基因组为模板,对phyA基因的成熟肽(1 347 bp)进行PCR扩增.再将PCR产物克隆入pMD18T质粒,经DNA测序和氨基酸分析、鉴定正确后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建工程菌Lactobacillus MG1363-pMG36e-phyA.重组乳酸菌表达载体pMG36e-phyA的构建,可望获得大量、高活性植酸酶,为研制多功能微生态制剂奠定基础.     

CMV启动子克隆及其在植物体内的表达

根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.     

日本脑炎病毒(JEV)prME的克隆及其植物表达载体构建

为研究乙脑亚单位口服疫苗,根据Genbank已发表的日本脑炎病毒（JEV）prME基因序列,设计引物,PCR扩增出5锚含有Kozak box,3端含有SEKDEL编码区的prME,克隆入pMD18-T载体中,经过序列测定后,用SnaBI和BamHI酶切消化将prME克隆入用EcoICRI和BamHI酶切消化的质粒pBI121 CaMV35S启动子和NOS终止子之间形成一个表达盒,再用HindⅢ,EcoRI酶切消化将该表达盒克隆入相同酶切的质粒pCAMBIA1301中,获得含有prME的植物双元表达载体．     

拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建

文章提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR扩增出HIS1-3基因的cDNA片段,连接到pEASY-T1Simple载体上,转化到Trans1-T1感受态细胞内,筛选阳性单克隆并抽提质粒。利用限制性内切酶Eco91Ⅰ和NcoⅠ对质粒pEASY-T1-HIS1-3和植物表达载体pCAMBIA2301进行完全双酶切,通过电转化法,将重组表达载体pCAMBIA2301-HIS1-3导入根癌农杆菌C58中以期获得携带HIS1-3基因的根瘤农杆菌株,为研究HIS1-3基因的抗逆分子机理以及遗传改良作物抗逆性奠定了基础。     

Cloning, construction of prokaryotic expression vector and expression ofEscherichia coli cytosine deaminase gene

Cytosine deaminase gene ofEscherichia coli strain H-30 was cloned, and its initiation codon of ‘GTG’ was mutated to ‘ATG’ by PCR. Prokaryotic recombinant expression vector pBV220-CD was constructed. Clone with high enzyme activity were selected by detecting their specific activity of cytosine deaminase. 5-FC(5-FC, 5-fluorocytosine) could induce the lethal toxicity to cells containing active CD gene. DNA sequence analysis indicated that there were 16 altered bases and 5 of them resulted in the alteration of amino acids in predicted peptide by comparing DNA sequence of the clone H-30-CD-11 with high enzyme activity with CD gene reported in Gene Bank.     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

白桦BpTCP7基因启动子的克隆及表达分析

【目的】研究BpTCP7启动子的表达模式,为深入分析BpTCP7基因功能提供一定参考。【方法】克隆了BpTCP7基因上游1 791 bp启动子序列,通过PLACE和Plant CARE网址对顺式作用元件进行分析,然后转入拟南芥,并分析BpTCP7启动子的组织表达特性及盐、旱胁迫应答反应。【结果】BpTCP7启动子序列中含有与细胞周期、开花、叶片发育、激素及胁迫响应等相关的顺式作用元件。该启动子在拟南芥中的表达模式呈现为营养生长阶段和生殖生长阶段均有表达,且在叶片中表达明显,与此同时,BpTCP7启动子在幼嫩、成熟叶片的边缘均有表达。与对照相比,NaCl、PEG胁迫诱导处理后BpTCP7基因表达量有升高的现象。【结论】BpTCP7基因参与白桦的叶片发育、激素应答、胁迫响应(盐、干旱)等生物学过程,对营养、生殖生长阶段各组织器官的发育也有一定的调控作用。     

新型肠毒素蛋白SElK编码基因的克隆测序、生物信息学分析和表达载体构建

采用微波加热法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,根据NCBI上登录的肠毒素基因sek设计引物,PCR克隆selk基因,对selk基因测序并进行生物信息学分析,在此基础上构建重组表达质粒p ET-32a(+)-selk.测序结果表明本研究克隆得到具有正确编码序列的新型肠毒素selk基因;Protparam分析表明在一级结构水平上该蛋白具有较高的热稳定性;亲疏水性分析表明SEl K蛋白是一个亲水性较高的蛋白质;同源建模表明SEl K蛋白的domain B结构域缺乏传统肠毒素所具有的胱氨酸环,但SEl K蛋白domain B中β-折叠片数量比传统肠毒素更高.这些结果为进一步研究SEl K蛋白的结构与功能奠定基础.