HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析

设计一个270bp的丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位抗原基因（PCX）,与β－半乳糖苷酶（GZ）基因融合后,在高浓度肉汤培养基中,于转接1％量后3．25h,用终浓度为1mmol／LIPTG诱导4h发酵表达,其表达量最高,约占50％总蛋白量,表达产量GZ－PCX以包含体形式存在．利用改良的包含体纯化及溶解方法,可获得溶解率＞90％,纯度为96．2％的产物GZ－PCX,且包含体溶解产物较好保存其蛋白酶活．对PBS／EDTA透析,GZ－PCX蛋白的β－半乳糖苷酶活性可升高4倍,对H2O／EDTA透析其活性则明显下降．     

β—半乳糖苷酶基因在HeLa细胞中瞬时表达的动态研究

本文研究了由ＳＶ４０早期启动子和增强子启动的β－半乳糖苷酶基因在ＨｅＬａ细胞瞬时表达的动态情况。外源β－半乳糖苷酶基因经磷酸钙方法导入受体细胞５０ｈ后其酶活性为６０ｍｉｌｌｉｕｎｉｔｓ，该酶活性维持一段时间后呈下降趋势，经转染２７０ｈ后，该酶活性降为０。此外本文结果还表明，携带有β－半乳糖苷酶基因的质粒对受体细胞ＨｅＬａ具有较高的转染效率。     

嗜热芽孢杆菌β—半乳糖苷酸发酵条件研究

以嗜热芽孢杆菌为菌种,研究发酵生产β－半乳糖苷酸的条件,应用均匀设计优化发酵培养基组成,结果为：服糖０．５、蛋白胨２．０、牛肉浸膏２．０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１。在温度５５℃、初始ＰＨ７．０、摇床转速２００ｒ／ｍｉｎ和１０％接种量条件下,发酵２４ｈ,β－半乳糖苷酸酶活力达１３．２Ｕ／ｍＬ。在乳糖水解反应中,证实该酶能催化转半乳糖苷反应,合成半乳糖低聚糖。     

熊猫豆β—D—半乳糖苷酶的基本性质研究

经硫酸铵分级分离,DEAE－cellulose 52,CM-cellulose 52和Sephacryl S 100HR凝胶过滤层析方法从熊猫豆黄化苗中获得了一种β－D－半乳糖苷酶,活性收率为8．0％,纯化倍数为245。经PAGE显示单一蛋白着色带,用IEF－PAGE测定其PI为4．1。SES－PAGE显示2条蛋白着色带,其相应分子量分别为40kD和29kD.Sephadex G200层析法测得表观分子量为68kD,以ONPG和PNPG为底物测得该酶的表观Km分别为3.02mmol/L和0．33mmol/L。最适pH为4．2,最适温度为52℃。以乳糖为底物测得表观Km为43mmol/L.HgCI2,DTNB,NEMI,半乳糖和乳糖对酶表现出不同的抑制作用。对某些金属离子和化学修饰剂对酶活性的影响也进行了探讨。     

米曲霉β—半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

研究了温度、ＰＨ酶量和起始乳糖浓度对低聚半乳糖合成的影响,发现乳糖水解为单糖和合成低聚糖所需的最佳条件并不相同;     

β—半乳糖苷酶基因在小鼠乳腺细胞表达的研究

构建了以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）５′区２．６ｋｂ为调控序列,指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒,采用直接注射质粒于乳腺的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性,证实ＷＡＰ基因调控序列的功能正确性,可以用于转基因动物乳腺表达研究,同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．     

门冬氨酸（537）—β—半乳糖苷酶的纯化

本文用硫酸铵分部沉淀,DEAE-BioGel A柱层析及FPLC Superose 12纯化了定位突变的E.Coli门冬氨酸(537)-β-半乳糖苷酶,总纯化倍数为167,酶活力回收55％,经Phast-Gel电泳鉴定为均一制剂,它的分子量及分子形式皆同天然E.Coli β-半乳糖苷酶。     

乳酸克鲁维酵母（Kluveromces lactis）β—半乳糖苷酶的稳定性 …

探讨了乳酸克鲁维酵母（Ｋ．Ｌａｃｔｉｃ）β－半乳糖苷酶金属离子稳定性和热稳定性。证明某些金属离子对β－半乳糖苷酶具激活作用,另一些金属离子对β－半乳糖苷酶活性影响不大,但是在高浓度的条件下均地酶活性不同程度的抑制作用。Ｃａ＾２＋对酶的抑制到盐,脱脂乳以及Ｍｇ＾２＋,Ｍｎ＾２＋所恢复。     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

β－半乳糖苷酶基因在HeLa细胞中瞬时表达的动态研究

本文研究了由ＳＶ４０早期启动子和增强子启动的β－半乳糖苷酶基因在ＨｅＬａ细胞瞬时表达的动态情况．外源β－半乳糖苷酶基因经磷酸钙方法导入受体细胞５０ｈ后其酶活性为６０ｍｉｌｌｉｕｎｉｔｓ，该酶活性维持一段时间后呈下降趋势，经转染２７０ｈ后，该酶活性降为０．此外本文结果还表明，携带有β－半乳糖苷酶基因的质粒对受体细胞ＨｅＬａ具有较高的转染效率．     

β—淀粉酶基因在黄单胞菌中的克隆及表达

广泛寄主范围载体ｐＫＴ２１０可在辅助质粒ｐＲＫ２０１３的协助下转移进入黄单胞菌（革兰氏阴性）中并能稳定存在；来源于枯草杆菌的β－淀粉酶基因与载体ｐＫＴ２１０形成重组质粒ｐＹＬ１，并以其转化大肠杆菌；通过三亲本接合将ｐＹＬ１引入带有利福平抗性的黄单胞菌ＮＫ－０１－Ｒ中，通过抗性选择接合子，并测定接合子的淀粉酶水解能力及产胶能力。本文获得一株黄原胶产量比出发菌株提高２０％，且淀粉酶水解能力显著提高的工     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。