杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达

在杂合启动子ＡＤＨ２－ＧＡＰＤＨ控制下于酿酒酵母中表达乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因的过程研究中,确定系统表达的有效阻遏条件为在１０．０ｇ／Ｌ的葡萄糖浓度下进行细胞的预培养,采用稀释操作和碳源饥饿培养等较彻底的支阻遏方式以克服葡萄糖酵解产物阻遏对表达的影响。实验还显示了溶解氧浓度对表达的影响和乙醇流加方式对表达期酵母生长与表达的调节作用。实验获得主培养４５ｈ后湿菌体浓度为１８６ｇ／Ｌ,细胞内ｐ     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控

采用酵母杂合启动子PADH2－CUP1或PADH2－GAPDH及终止子TADH1，构建了一系列酵母表达载体．在这些表达载体中插入乙肝病毒表面抗原S－preS1融合基因SA－28后，将合乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒PHC11的BamHI位点．然后将表达质粒分别转化酿酒酵母Y16，Y19．对SA－28基因表达的研究表明，在酵母菌胞内实现了SA－28基因的高表达，且表达受葡萄糖浓度调控．     

乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达

以酵母载体ＹＦＤ５９为基础,将乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因正向插入组成型启动子ＰＰＧＫ１及终止子ＴＰＧＫ１间,得到表达载体ＹＦＤ５９－ＬＳＳ１。并将该表达载体分别转化ＢＪ２１６８,ＤＢＹ７４６,ＪＲＹ１８８,ＢＪ３５０５ ４株不同的酿酒酵母株。再将ＹＦＤ５９－ＬＳＳＩ质粒上的表达单元克隆至高稳定载体ｐＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点,构建成３个带有不同拷贝数和不同插入方向表达单元的表达载体;ｐＨＣ１     

融合表面抗原SA—28基因在Pichia pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８插入质粒载体ｐＡＯ８１５的ＥｃｏＲ Ｉ位点中,将其置于Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母ＡＯＸ１启动子控制下,利用电转化技术,融合基因表达单元链同ＨＩＳ４基因被整合到受体菌ＳＭＤ１１６８基因组中。对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明：ＳＡ－２８基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;ＳＡ－２８融合基因的表达产物具有Ｓ和ＰｒｅＳ１的双重抗原性。用     

融合表面抗SA-28基因在Pichia Pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原S-preS1融合基因SA-28插入质粒载体pAO815的EcoR Ⅰ位点中,将其置于Pichia Pastoris酵母AOX1启动子控制下.利用电转化技术,融合基因表达单元连同HIS4基因被整合到受体菌SMD1168基因组中.对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明:SA-28基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;SA-28融合基因的表达产物具有S和PreS1的双重抗原性.用CsC1密度梯度离心法纯化了表达产物,融合抗原活性峰位于密度为1.19 mg/cm3的区带.     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

新型抗菌肽基因设计,合成及其在酵母中的表达（Ⅰ）：杂合抗菌肽基 …

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码设计了一种新型抗菌肽基因。     

两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定

参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密码子,改造克隆杂合抗菌肽CA(1～7)M(4～11)和CB(1～7)M(4～11)基因,将改造后的基因克隆到pPICZα-A 载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM,转化宿主菌Pichia pastoris X-33,在甲醇的诱导下进行表达.实验结果表明,杂合抗菌肽获得表达,两种表达产物具有明显的抗菌活性.此外,本文还比较了二者的抗菌谱,分析了杂合肽的性质,优化了酵母电转化条件.     

人白血病抑制因子基因在酵母中的融合表达

用PCR突变的方法使人白血病抑制因子基因的终止密码子缺失,并与质粒pPICZαA上的myc表位及6个组氨酸处于同一读码框,构建融合表达载体pPICZαA-hLIF^M。通过氯化锂化学转化法使表达载体整合到毕赤巴斯德酵母X－33的基因组DNA中,转化子经甘油增菌和甲醇诱导,实现了hLIF基因在毕赤酵母表达载体系统中的表达。SDS－PAGE检测和Western blot分析结果表明在相对分子质量为61000处有一条人白血病抑制因子特异蛋白带。凝胶薄层扫描分析结果显示表达的目的蛋白占培养液上清总蛋白的33．3％。且该表达产物具有抑制小鼠畸胎瘤细胞F9克隆形成的活性。     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

乙型肝炎表面抗原基因在酵母中的表达——Ⅰ.HBsAg基因在酵母中的克隆

将乙型肝炎表面抗原基因组装进穿梭质粒,经E.coli扩增、鉴定后转入酵母细胞得到了转化子。经放射免疫分析,在此转化子中HBsAg未得到表达,可能是阅读框架不一致造成的。此外,我们对酵母DNA重组技术进行了摸索,并简化和改进了一些步骤。     

波氏假丝酵母启动子的克隆及新霉素基因的表达

报道了波氏假丝酵母（Candida boidinii)启动子的克隆,将克隆的启动子与Neo^ 基因重组构建了含Neo^r基因的表达载体YepNP181,转化波氏假丝酵母,实现了Neo^r基因在波氏假丝酵母中的表达,使波氏假丝酵母转化子能在含G418的抗性培养基上生长从而建立了Neo^r基因－G418选择系统,为外源基因在波氏假丝酵母中表达创造了条件。     

转甲状腺素蛋白基因在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK TTR质粒上TTR基因切下,分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K.将重组的pPIC9K TTR用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子.转化子经摇瓶发酵,上清液用SDS PAGE检测,有明显的rTTR表达.经DEAE sepharoseF.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析,得到蛋白纯度大于95%的rTTR.经Westernblotting,分子质量和等电点测定等证明,毕赤氏酵母表达的rTTR与人血浆提取的TTR极为相似.     

人白血病仰制因子基因在酵母中的融合表达

用ＰＣＲ突变的方法使人白血病抑制因子基因的终止密码子缺失，并与质粒ｐＰＩＣＺαＡ上的ｍｙｃ表位及６个组氨酸处于同一读码框，构建融合表达载体ｐＰＩＣＺαＡ－ｈＬＩＦＭ．通过氯化理化学转化法使表达载体整合到毕赤巴斯德酵母Ｘ－３３的基因组ＤＮＡ中。转化子经甘油增菌和甲醇诱导，实现了ｈＬＩＦ基因在毕赤酵母表达载体系统中的表达．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果表明在相对分子质量为６１ ０００处有一条人白血病抑制因子特异蛋白带．凝胶薄层扫描分析结果显示表达的目的蛋白占培养液上清总蛋白的 ３３．３％．且该表达产物具有抑制小鼠畸胎瘤细胞Ｆ９克隆形成的活性．     

肝癌差异表达基因HCUTAL2在酵母Pichia pastoris中的表达

利用正常肝组织和肝癌组织的mRNA,通过逆转录方法,将Cy3和Cy5二种荧光分别标记到2种组织的cDNA上,制备成cDNA探针,并与包含4096条各种人类基因的DNA表达谱芯片进行杂交及扫描,重复11次实验,通过计算机数据处理判定基因是否在上述2种组织中存在表达差异,从而鉴定参与肿瘤发生的基因,其中1类差异表达基因为CUTA的高度同源基因,该基因可能参与重金属离子在体的代谢,对该基因拟编码的蛋白质进行酵母表达。     

大肠杆菌中心人钠素基因在PL和T7启动子控制下的…

将Ｐ１噬菌体的ｒｅｆ基因与人心钠素的嵌合基因ＲＥＦ－ＡＮＰ分别克隆入带ＰＬ启动子和Ｔ７启动子的两种表达载体，获得高铲表达重组质粒ｐＺＪＭ１和ｐＺＪＭ４．ｐＺＪＭ１转化ＤＨ５α，ｐＺＪＭ４转化ＨＭＳ１７４，在表达细菌培养到ＯＤ６００＝０．２５时分别进行温度诱导和化学诱导，快速凝胶扫描结果表明ＲＥＰ－ＡＮＰ表达量各占细菌可溶性总蛋白的６７．１％和２８．１％；在ＯＤ６００＝１．０或２．０时进行诱导，均能     

LZ—8基因的克隆及其在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达

用PCR从灵芝（Gamoderma lucidum)基因组扩增免疫蛋白LZ－8基因，将其构建到酵母表达质粒pPICZaA中，采用电激转化法转化毕赤酵母，获得转化子。对其Sourthern杂交分析，结果表明LZ－8基因整合到毕赤酵母基因组。对转化酵母作发酵培养，SDS－聚炳烯酰胺凝胶电泳检测到LZ－8蛋白的表达。     

β—actin启动子控制的人尿激酶原基因在CHO细胞中…

本文将人尿激酶原ｃＤＮＡ基因插入到含β－肌动蛋白启动子的表达载体中，通过脂质体转化到中国仓鼠卵巢细胞内，经筛选得到稳定表达ｐｒｏ－ＵＫ基因的细胞株，用ＥＬＩＳＡ检测到细胞培养液中表达量为２－３ｍｇ／Ｌ。经过抗尿激酶的免疫亲和柱初步纯化细胞培养上清后得到表达产物。同时，在培养液中加入佛波酯ＰＭＡ后，发现它对目的基因的表达有促进作用。