人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ Ｈ Ｉ Ｖ２） 的原病毒基因组为模板,通过套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增得到了 Ｈ Ｉ Ｖ２ 的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｘ５ Ｘ１ ,获得了重组表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ３６ Ｅ Ｎ Ｖ． Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 对重组表达菌株诱导后, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

大肠杆菌基因启动子探针型载体的构建

利用ＰＣＲ技术将ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中的多克隆位点区（ＭＣＳ）及旁侧序列分别进行扩增,然后将扩增产物插入到已除去ＬａｃＺα基因的ｐＵＣ１８中,获得三个中间载体ｐＳＵＧＶ１,ｐＳＧＶ２和ｐＳＵＧＶ３,最后将ｐＳＵＰＶ２中无表达活性的新霉素磷酸转移酶Ⅰ（ＮＰＴⅠ）基因分别插入到三个中间载体的ＭＣＳ中,构建成功大肠肝菌基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,ｐＳＵＰＶ５和ｐＳＵＰＶ６．     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解     

电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者含ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸ ｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动子控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动子驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１     

人胰岛素原类似物（B—Arg—Arg—A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法将Ｃ肽为６个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成Ｃ肽仅为２个精氨酸残基的胰岛类原类似物基因，即把ＰＵＣ１８ＢＣ＇Ａ改建为ＰＵＣ１８ＢＲ２Ａ。再将ＰＵＣ１８ＢＲ２Ａ与ＰＪＧ１０５且为表达质粒ＰＪＧ１０７，使Ｂ－Ａ－Ａ与ＰＪＧ１０５编码的一种多肽成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的５８％。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

抗肿瘤因子内皮抑素基因的克隆及表达

为了克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白,从人胎盘组织中分离总ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出５７０ｂｐ的ＤＮＡ片段,并成功地克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,经序列测定证实为内皮抑素基因,用Ｘｐｒｅｓｓ本外表达了内皮抑素蛋白并纯化成功。     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

人抑癌基因nm23—H1在逆转录病毒载体上表达的研究

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。     

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马铃薯中的PLRV

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３′端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测．结果表明，３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高．可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低量为２７．８ｐｇ／ｍｌ，未转ＣＰ基因接种ＰＬＲＶ的马铃薯叶片提取液的最高稀释度为１３７５．接种ＰＬＲＶ的转ＣＰ基因的抗性马铃薯块茎芽和叶片提取液的最高稀释度为０～１／１５．此探针和只转入病毒外壳蛋白基因，不接种ＰＬＲＶ的转基因马铃薯汁液不发生反应．表明，探针只与ＰＬＲＶ基因组ＲＮＡ特异反应，而不与外壳蛋白基因及其ｍＲＮＡ反应，从而为表达ＣＰ基因的转基因马铃薯中ＰＬＲＶ的检测和抗病性鉴定建立了一种可靠的灵敏的分子生物学技术．此项技术已用于转ＣＰ基因马铃薯Ｄｅｓｉｒｅ，Ｆａｖｏｒｉｔａ，乌盟６０１和虎头的抗病性鉴定     

鼻咽癌细胞株,瘤株中EBV—LMP1基因的检测及变异性分析

采用ＰＣＲ法检测了不同代次的鼻咽癌细胞株、瘤株（ＳＵＮＥ／ＳＵＮＴ）中的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因片断，并分析其变异性。结果发现直到１３１代ＳＵＮＥ、３０代ＳＵＮＴ中仍然能检测到ＬＭＰ１基因片断，且在传代过程中ＬＭＰ１基因未发生变异。但与Ｂ９５－８中的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因相比，ＬＭＰ１基因发生了变异，表现为Ｘｈｏｌ、Ｍｓｐ酶切位点的消失和ＳＳＣＰ单链迁移率的不同。该结果提示变异的ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因可能与ＳＵＮＥ／ＳＵＮＴ肿瘤的特性有一定的相关性。     

大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因在小菜蛾细胞中的表达

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的杆状病毒转移载体．ｐＡｃ３６０－β－ｇａｌ与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－ＰＸ２－ＨＮＵ２,Ｐｘ）,利用Ｘ－ｇａｌ空斑检测分析,β－ｇａｌ基因成功地插入ＡｃＮＰＶ基因组中,得到重组病毒Ａｃ－β－ｇａｌ,重组病毒在Ｐｘ细胞中表达出受ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因启动子控制的具有生物活性的外源基因表达产物──β－ｇａｌ．     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）。利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＥＸ。ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表     

关于一类BCI-代数及其伴随半群的性质

研究了一类特殊ＢＣＩ－代数Ｘ＝Ｐ（Ｘ）∨ＳＰ（Ｘ）及其伴随半群,讨论了它的一些性质,得出Ｍ（Ｘ）＝Ｍ（Ｐ（Ｘ））∨Ｍ（ＳＰ（Ｘ））．证明了Ｓ是Ｍ（Ｘ）的真理想的充要条件是Ｓ为Ｍ（ＳＰ（Ｘ））的真理想;Ｍ（Ｘ）是剩余半群的充要条件为Ｍ（Ｐ（Ｘ））是剩余半群．当Ｍ（Ｘ）是剩余半群时,每一个ＢＣＩ－代数Ｘ＝Ｐ（Ｘ）∨ＳＰ（Ｘ）均可嵌入到一个ＢＣＩ－代数Ｘ＊＝Ｐ（Ｘ＊）∨ＳＰ（Ｘ＊）中,且Ｘ是Ｘ＊的子代数     

BYDV CP基因转化小麦原生质体及转基因植株再生

用原生质体融合技术与ＰＥＧ介导的直接转基因方法相结合，使高频率分裂的小麦济南１７７悬浮细胞系原生质体与具有分化能力的小麦济南１７７胚性意伤组织原生质体融合，形成具有分裂和分化能力的融合细胞；同时，利用ＰＥＧ对原生质体的直接转基因作用，将带有抗病毒基因（ＢＹＤＶＣＹｇｅｎｅ）的质粒Ｐｐｐ１５与带有抗性选择标记基因的质粒严ＰＢｌＡｃｔＳＮ导入融合细胞中．经抗性筛选获得抗潮霉素（Ｈｍ）的阳性克隆并再生植株．对再生植株作ＰＣＲ检测表明，ＣＰ基因已整合到转化植株的基因组中并稳定表达．     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA—28融合基因在酵母中的表达？…

采用酵母杂合启动子ＰＡＤＨＺ－ＣＵＰ１或ＰＡＤＨＺ－ＧＡＰＤＨ及终止子ＴＡＤＨ１,构建了一系列酵母表达载体。在这些表达载体中插入乙肝有面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８后将含乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒ＰＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点。     

携带TIMP-1基因逆转录病毒载体的构建及其实验研究

构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，构建ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ；经限制性内切酶酶切、电泳鉴定其结构正确后，用电穿孔法对体外培养的ＰＡ１３７包装细胞进行基因转移，Ｇ４１８筛选阳性克隆，收集上清，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系的研究．构建获得ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ，有效滴度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ～１０６ＣＦＵ／ｍＬ．本研究构建获得的ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体，在感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的研究中得到有效应用     

研究聚ADP核糖基化作用与细胞恶变关系的双基因真核表达重…

本文将聚ＡＤＰ核糖聚合酶基因１．４ｋｂ部分序列反向插入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ和ｐＳＭＧ中，同时１２位密码子突变的活化ｒａｓ癌基因也一同克隆到上述载体中，从而获得具有不同真核基因筛选标记的双基因真核表达重组ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－ａｒＴ２４，及ｐＳＭＧ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，上述质粒的构建成功为研究聚ＡＤＰ核糖基化作用与细胞恶变的关系提供了一种新的分子模型。     

利用反义RNA探索外源基因丢失的分子机理

利用反义ＲＮＡ技术研究了调控ＰＡＲＰ酶基因的表达对外源基因整合稳定性的影响。将ＰＡＲＰ基因ｃＤＮＡ的部分序列反向插入到真核表达载体ｐＳＭＧ中,将重组质粒分别导入携带有外源基因的细胞中,地塞米松诱导反义ＰＡＲＰ基因的表达后,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测。结果表明,外源基因仍保留在基因组中,这意味着外源基因的丢失并不是由于单一ＰＡＲＰ酶活性降低所致。