高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

细叶石斛的位点特异性PCR鉴别

根据细叶石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS 序列,我们设计了位点特异性PCR鉴别引物 XY-JB01S和XY-JB01X,对细叶石斛进行了成功的DNA分子鉴别.在进行位点特异性鉴别PCR之前,首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增,以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度.当退火温度上升为64℃, 只有细叶石斛的模板DNA 能被扩增出来,而其它的37种石斛属植物均为阴性.该鉴别反应重复性好,已在鉴别细叶石斛中发挥重要作用.与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点.     

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS序列，设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC—JB01S和DC—JB01x，并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别．在进行位点特异性PCR鉴别之前，首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增，以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度．当退火温度上升为64℃，只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来，而其它的37种石斛属植物均为阴性．该鉴别反应重复性好，已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用．与DNA测序鉴别方法相比，位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点．     

应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒

为了简化聚链反应（PCR）程序和加快检测速度,将二温式PCR与多重PCR结合起来,建立一种同是检测鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和鸡传染性喉气炎病毒（ILTV）的二温式重PCR技术,试验根据IBV和ILTV的基因文库,设计2对分别与IBV和ILTV某段基因序列互补的引物。用这2对引物同一样品中的IBV、ILTV核酸模板进行二温式多重PCR扩增,结果均同时得到2条特异性大小与实验设计相符的1720bp(IBV)和647bp(ILTV）的扩增带,而对其他6种禽病病原的扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明明,该二温式多重PCR技术检出10pg的IBV RNA模板和10pg的ILTV DNA模板。     

中药材龟甲基因组DNA提取及PCR鉴定特征

目的探讨中药材龟甲基因组DNA提取方法,建立聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别龟甲真伪的分子指纹特征.方法采用改良盐析法提取新鲜龟甲、龟甲易混品种及市售龟甲样品的基因组DNA.从Gen Bank数据库中下载中华金龟、中华草龟及5种常见伪品龟甲细胞色素b的基因序列,应用Premier 5.0引物设计软件设计特异性引物,对龟甲样品进行PCR扩增.结果改良盐析法提取新鲜龟甲样品DNA纯度均在(1.80±0.12)之间,基因组DNA大小为16.6×103bp.所设计的特异性引物只能扩增正品龟甲,扩增片段为78 bp,而伪品龟甲不能扩增出相应片段.结论改良盐析法可以从龟甲样品中提取到较高质量的基因组DNA.PCR技术鉴别中药材龟甲真伪具有特异性高、方法简便快捷、实用性较强的特点,在中药材龟甲真伪鉴别方面具有较高的应用价值.     

甘蓝型油菜S-GT基因克隆、hpRNAi载体构建及遗传转化

根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以甘蓝型油菜总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长.根据获得的基因序列设计引物扩增出S-GT基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到带有本实验所构建的种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了油菜S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体.通过根瘤农杆菌EHA105介导,转化甘蓝型油菜‘hubu 11'的子叶柄,诱导愈伤组织分化出绿芽,进而再生出完整的植株.通过PCR初步鉴定获得了58株转基因阳性植株.     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

基于PCR-RFLP的西洋参和人参指纹特征鉴定

目的建立西洋参与人参限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)的鉴定方法.方法采用改良的CTAB法从西洋参和人参中提取基因组DNA.应用生物信息学软件设计西洋参与人参核糖体DNA ITS序列的特异性引物,利用PCR技术对指定序列进行扩增,并通过RFLP方法酶切后进行指纹图谱的鉴别比较.结果提取西洋参与人参基因组DNA19 kb,并扩增核糖体122 bp大小的基因片段,经酶切后西洋参为80 bp和42 bp长度的两条片段,而人参仍然为122 bp长度的单一片段.结论西洋参与人参DNA具有特异性酶切位点,可作为西洋参与人参鉴定的有效方法,该方法简便快速,结果可靠.     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

青鳉DMY基因的克隆及其在性别鉴定中的应用

提取雄性青鳉成鱼基因组DNA为模板,利用特异性引物,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得1 908 bp的特异性条带.经测序证明为DMY基因片段,其核苷酸序列由3个外显子和2个内含子组成,可连续编码150个氨基酸.建立准确而有效的鉴定任意发育阶段青鳉个体雌雄性别基因型的方法,即利用管家基因——肌动蛋白基因PCR扩增条带的有无验证DNA样本提取和PCR扩增的有效性,同时利用雄性DMY基因的PCR扩增条带的有无鉴定青鳉个体的雌雄性别.对随机选取的成鱼和新生鱼卵样本,应用该方法可成功地鉴定出青鳉个体的雌雄性别.     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5''端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物，以绵羊基因组DNA为模板，PCR扩增出1042bp的特异性片段，连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物，在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。     

几种鹤性别的分子生物学鉴定

以RAAV01和RAAV02两条随机核苷酸加聚体为引物,通过随机扩增片段多态DNA的方法,在白头鹤,白枕鹤,丹顶鹤等3种4对不同个体中,发现一条约300bp的雌性个性特异带,并应用这一方法成功地鉴别了未知性别的丹顶鹤个体,同时参照已知动物CHD基因序列的设计合成CHD基因引物,采用PCR方法在丹顶鹤雌性个体中扩增出一条206bp的片段,序列分析表明,该序列与已知其他鸟类CHD－W,CHD－Z基因的编码区和内含子区都有较高的同源性。     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆及序列分析

根据U．Washington报导的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列，设计1对引物，利用PCR的方法扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因。通过琼脂糖凝胶电泳，所得E1的片段略小于500bp，与引物设计跨幅片段476bp相吻合。将此片段连接到T载体，经蓝白斑筛选、PCR鉴定、测序及DNA序列分析，结果表明：克隆VirD1基因编码序列与报导的序列同源性达100％，说明通过PCR方法获得的VirD1基因片段是正确的，为进一步研究该基因的表达和活性奠定了基础。     

PCR技术在动植物检疫中的应用

一、PCR技术基本原理多聚酶链式反应,英文缩写为PCR,又称无细胞分子克隆法,是近年发展起来的一种快速的特定DNA片段体外扩增法,即一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法.PCR利用两个寡聚核苷酸杂交对应链目的区域的侧翼上,一连串反应包括模板变性作用、引物退火和由DNA聚合酶酶促退火、引物延伸的周期性重复产生特定片段的指数积聚.该片段的末端由引物的5′末端决定.因为一个周期所合成的引物延伸产物可作为下一个周期的模板,所以靶DNA拷贝数目在每个周期中近似地呈倍数增加.这样,20个PCR周期可得约百万(2~(20))倍扩增.把扩增产物放进电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼能看见扩增特异区段的DNA带.     

利用降落PCR扩增KMT-1基因

用试剂盒提取一株牦牛源多杀性巴氏杆菌(C47-8)基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增KMT-1基因片段。结果表明:降落PCR法扩增出KMT-1基因片段的特异性条带与目的片段长度一致,普通PCR法没有结果。相同的反应体系,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

枇杷番茄红素β环化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物番茄红素β环化酶（LYC）基因的保守区序列，设计1对PCR引物，以枇杷基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增长约300bp的DNA片段，克隆人pMD-18T载体，测得该基因片段长312bp，编码102个氨基酸，属于开放阅读框的一部分，不含内含子。在GenBank中进行同源性检索表明该序列与苹果番茄红素β环化酶基因同源性为97％，由此推测这个基因属于枇杷番茄红素β环化酶基因。     

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对Gen Bank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物. PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.     

16S rDNA和recA-gene对乳酸菌Ⅱ32的鉴定

对乳酸菌Ⅱ32进行了生化实验.以菌株Ⅱ32的总DNA为模板,采用细菌通用的引物,对其16S rDNA进行特异扩增,并进行序列测定,将测定结果与GenBank DNA数据库中已知菌种的16S rDNA序列通过BLAST软件进行分析比较,初步确定该菌株为戊糖乳酸菌、植物乳杆菌或类植物乳杆菌.采用recA-gene约300bp的特异扩增片段最终确定乳酸菌Ⅱ32为类植物乳杆菌.