人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

牛肠激酶轻链基因的构建与原核表达

肠激酶作为一种丝氨酸蛋白酶,能够识别顺序-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,水解赖氨酸C端的肽键.根据NCBI中牛肠激酶基因序列(L19663)设计18条引物,通过重叠延伸拼接PCR技术(SOE-PCR)扩增两端带有酶切位点的牛肠激酶轻链基因.构建表达载体pET32a-EK,表达载体转化E.coli BL21 (DE3),利用IPTG诱导表达嵌合蛋白,并用离子交换柱层析纯化肠激酶,获得了高纯度的重组肠激酶轻链蛋白,为大规模生产打下了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.     

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的：克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化．方法：从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV—EKL,转化大肠杆菌BL21（DE3）,调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白．结果：所表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析,相对表观分子质量约为31kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46％;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性．结论：成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础．     

幽门螺杆菌hpaA基因克隆及其蛋白的表达纯化

目的克隆幽门螺杆菌hpaA基因,构建hpaA-pET-32a重组质粒,并对其重组蛋白进行表达纯化,为其进一步的免疫研究提供实验基础.方法采用PCR方法,从幽门螺杆菌临床分离菌株中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,通过表达载体pET-32a构建的hpaA的重组质粒,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,最后对重组蛋白进行纯化.结果重组质粒hpaA-pET-32a经双酶切、PCR及测序证明构建成功,经诱导重组蛋白成功表达,以包涵体蛋白的形式存在,对其纯化后获得了高纯度的重组蛋白.结论成功构建幽门螺杆菌hpaA的原核表达系统,并对其重组蛋白进行了表达纯化.     

重组大鼠溶菌酶N端多肽的原核表达及其对晚期糖基化终产物的结合作用

目的:探讨溶菌酶N端多肽片段基因的重组并在原核中表达,研究该片段与晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的结合作用。方法:从SD大鼠外周血白细胞中抽提总RNA,经逆转录并扩增大鼠溶菌酶N端基因片段,以质粒pET-30 a( )为载体构建表达质粒pLY77。含pLY77的工程菌Rosetta(DE3)经IPTG诱导,对该重组多肽进行高效表达。表达产物经N i -NTA琼脂糖柱层析纯化后,得到的溶菌酶N端多肽片段LY77经SDS-PAGE和W estern印迹法鉴定,ELISA法分析体外结合活性。结果:LY77在Rosetta(DE3)中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,相对分子质量约为11 000;LY77对体外制备的晚期糖基化蛋白BSA-AGEs具有显著的结合活性。结论:LY77对AGEs具有很高的亲和力,为进一步探讨LY77可能应用于体内促进AGEs的清除和参与免疫调节作用奠定基础。     

构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.     

构建重组人CatSper1特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-599)原核表达载体并表达重组抗原。方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体。测序鉴定后转化工程菌株E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白。用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况。结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原。结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsper1特异抗原。     

海洋放线菌S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因的克隆、表达和纯化

海洋放线菌S.arenicola CNS-205是首次报道的专属海洋性放线菌属Salinispora的代表菌株之一.选取海洋放线菌S.arenicola CNS-205非核糖体多肽合成酶氨基酸腺苷化结构域基因sare 0357,对其进行生物信息学分析后进行原核重组质粒的构建和表达及蛋白纯化.分别构建了pET-28a-sare 0357和pGEX-KG-sare 0357重组质粒,并转化E.coli BL21(DE3)进行不同诱导条件的诱导表达,sare 0357基因均以包涵体的形式表达.收集Sare0357重组蛋白包涵体,选取6mol/L的盐酸胍对其进行变性并将变性后的重组蛋白进行镍柱纯化.得到了可溶性的Sare0357融合蛋白.     

exendin-4表达载体构建及其在大肠杆菌中分泌表达

目的:研究新型抗糖尿病药物exendin-4的分子作用机制,为exendin-4的大规模生产奠定基础.方法:采用重叠PCR法扩增出exendin-4的完整序列,并将其克隆至表达载体pET22b上,得到重组质粒pET-Exn4.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,超声破碎表达产物,Tricine-SDS-PAGE分析exendin-4表达.结果:PCR、酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pET-Exn4,Tricine-SDS-PAGE结果表明ex-endin-4基因在大肠杆菌中获得了分泌表达.结论:成功构建了exendin-4的重组表达载体并在大肠杆菌中实现分泌表达.     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将ACLSV CP基因克隆到表达载体ρET-28a( )中，转化大肠杆菌BL21，筛选得到阳性克隆pET-ACP，用IPTG诱导使其表达，SDS-PAGE电泳分析表明，预期的22kD外壳蛋白在大肠杆菌中得到大量表达，并加以纯化，用于制备抗血清。     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及免疫原性分析

利用PCR技术扩增了SHV-12 ESBLs目的基因,并将目的基因亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a-SHV-12转化于表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳分析.结果表明,目的蛋白SHV-12 ESBLs相对分子质量为30 KDa,经蛋白质印迹检测证...     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。