耐辐射球菌抗氧化系统中的一个新成员dr1127

构建了一个耐辐射球菌(Deinococcus radioduran)未知基因dr1127的功能缺陷株MT1127. γ射线和H₂O₂处理R1和 MT1127的结果表明, dr1127基因的缺失影响了耐辐射球菌的辐射抗性和氧化抗性. 测试了指数生长期和稳定期的R1株和 MT1127株的细胞提取物活性氧自由基清除能力, 结果发现, 无论是超氧阴离子、H2O2还是羟自由基, MT1127株均表现为更弱的自由基清除能力, 这些结果与前面的生存率实验结果相吻合, 也在一定程度上帮助我们理解dr1127基因的功能. 同时, 在大肠杆菌BL21 (DE3)系统中成功表达了dr1127基因产物, 纯化得到46 kD的蛋白产物, 利用Fe²⁺-H₂O₂氧化损伤系统, 检测到DR1127蛋白在体外保护DNA免受氧化损伤的功能, 并测到该蛋白能通过结合双链DNA的方式来实现保护DNA的功能. 本研究揭示了dr1127基因在氧化损伤胁迫中的功能, 为耐辐射球菌庞大而又复杂的抗氧化系统增添了新的成员, 也为深入研究耐辐射球菌的超强辐射抗性开辟了一个新的研究思路.     

中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ A-Rich区的功能鉴定

DNAβ是近年来在一些单组分双生病毒中发现的一类新型卫星DNA分子, DNAβ对于这些病毒诱导典型的病害症状是必需的. DNAβ上含有3个相对保守的区域: 共同区、βC1基因和A-Rich区(A含量 > 60%). 在对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ βC1基因的功能突变研究的基础上, 对TYLCCNV-Y10 DNAβ上的A-Rich区进行了功能鉴定. 对TYLCCNV-Y10 DNAβ A-Rich区进行缺失突变后发现, A-Rich缺失突变体依然能够在植物中稳定复制和系统移动, 因此A-Rich区对于DNAβ的复制并不是必需的. 免疫捕获PCR检测发现, A-Rich缺失突变体能够包裹在TYLCCNV-Y10 DNA-A编码的外壳蛋白之中, 表明它并不能决定DNAβ的包裹, 但是A-Rich区的缺失使病毒症状减弱.     

重组逆病毒介导的Immunocaspase-3分泌性T细胞对ErbB2阳性乳腺癌的杀伤作用

将Immunocaspase-3基因转染Jurkat T淋巴细胞, 使其稳定地分泌性表达靶向促凋亡蛋白Immunocaspase-3, 间接免疫荧光检测表明该蛋白可内化进入ErbB2阳性的SKBr3乳腺癌细胞, 细胞计数结果表明乳腺癌细胞的生长和增殖受到明显抑制. 进一步将Immunocaspase-3基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX, 转染PA317细胞进行包装, 挑选高滴度的包装细胞株收获病毒. 用收获的病毒感染刺激分裂的人外周血T淋巴细胞, 经筛选后通过尾静脉注射给荷有SKBr3乳腺癌的裸鼠, 观察到肿瘤生长明显受到抑制(抑制率 73.25%), 裸鼠存活时间较对照组延长80.95%. 免疫组织化学染色结果表明裸鼠肿瘤组织中有Immunocaspase-3蛋白分布, TUNEL检测证实肿瘤细胞发生凋亡. 上述结果表明, T淋巴细胞分泌的Immunocaspase-3在裸鼠体内可以识别和进入ErbB2阳性的乳腺癌细胞, 抑制肿瘤生长.     

随机断裂模型对7Li离子致DNA链断裂碎片长度分布的分析

用随机断裂模型分析了重离子电离辐射致质粒DNA双链断裂(dsb)的片段长度分布, 随机断裂模型中的u为平均每个DNA上的双链断裂数, 并可直接由实验得到. 分析表明在低剂量时, 随机断裂模型都不能描述DNA的碎片分布. 在较高剂量时, 随机断裂模型可以较好地符合实验结果, 说明了在较大剂量情况下, 重离子诱发的DNA碎片的长度分布具有随机统计性质.     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节

EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1 (LMP1)是重要的致瘤蛋白, 可活化包括AP-1在内的多个转录因子. 转录因子功能性活化体现在其与靶基因启动子结合, 反式激活靶基因转录, 调节靶基因的表达, 从而发挥其生物学效应. 最近发现LMP1可介导c-Jun/Jun B活性异源二聚体的形成, 为寻找其靶基因提供了重要的依据. 采用生物信息学技术, 确定了c-Jun/Jun B活性异源二聚体调控的潜在靶基因p16; 在此基础上, 利用建立的Tet-on系统调控LMP1表达的细胞系, 采用间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术、Western blot方法、荧光素酶活性检测、Super-EMSA方法和流式细胞术, 探讨LMP1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节功能. 结果表明, LMP1介导的c-Jun/Jun B异源二聚体可下调p16启动子活性及其表达, 并影响细胞的演进. 该研究在AP-1信号传导通路和细胞周期之间建立了新的直接联系, 从而为肿瘤发病机制研究提供了新的思路和实验模式.     

水稻F1花粉不育基因座S-b的精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍, 开展杂种不育基因的克隆和功能分析对于克服和缓解亚种间杂种的不育性具有重要的意义. 本研究在S-b座位初定位的基础上, 根据水稻基因组的序列发展微卫星标记, 将S-b座位定位在微卫星标记PSM8和PSM202之间. 为了精细定位S-b座位, 以S-b座位的近等基因系为材料培育了包含有3910株的F2作图群体, 同时根据PSM8和PSM202界定范围内的基因组序列发展了2个微卫星标记, 2个插入缺失多态性标记和4个CAPS标记. 利用作图群体中的重组株进行花粉育性表型与新发展标记基因型的连锁分析, 结果表明标记W4与S-b座位完全连锁, 而标记A8和A14位于S-b座位的两侧, 与S-b座位的遗传距离分别为0.026和0.038 cM. 将多态性标记与该区域克隆的序列进行整合, 结果表明, 新发展的多态性标记锚定在了AC093089, AC079021和AC134931三个首尾相连的克隆上. 根据各标记在物理图谱上的位置, 最终将S-b座位界定在了A8与A14之间27 kb的物理距离内. RiceGAAS注释表明该区域有7个预测ORF. 该结果为S-b座位进一步的功能分析奠定了基础.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

亚硝胺β-位代谢物与DNA碱基作用机理的

用从头计算方法在RHF/6-31G(d)和MP2/6-31G(d)水平上对甲基乙基亚硝胺代谢产生的β-位硫酸酯按照是否经过邻基参与作用与DNA碱基发生烷基化反应的不同假设机理进行了研究. 对所有反应物、产物、中间体和过渡态进行了全几何构型优化, 得出反应活化能和内禀反应坐标等参数. 结果表明, 邻基参与作用有力地促进了β-位硫酸酯化烷基亚硝胺与DNA碱基的烷化反应. 在相同水平上用Onsager溶剂效应模型反应场进行了计算, 表明在极性溶剂中邻基参与反应的活化能明显降低.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

耐辐射奇球菌RadA蛋白参与DNA损伤修复过程

RadA是一个高度保守的蛋白. 在古细菌中, RadA蛋白具有RecA类似的功能并在同源重组过程中起关键作用. 在大肠杆菌中, RadA蛋白也参与了同源重组和DNA损伤修复过程, 但远没有在古细菌中的功能那么重要. PSI-BLAST结果表明, 与古细菌以及真核细胞中RadA蛋白相比, 耐辐射奇球菌RadA蛋白和细菌中的RadA的相似性更高. 研究发现, 耐辐射奇球菌radA基因的突变增加了耐辐射奇球菌对γ射线和紫外线照射的敏感性, 但对过氧化氢氧化胁迫的抗性没有影响. 耐辐射奇球菌和大肠杆菌radA基因均能完全补偿突变体对γ射线和紫外线辐照的抗性. 进一步的结构域功能分析表明, 与radA突变体的抗性相比, 锌指结构域的缺失导致耐辐射奇球菌对γ射线和紫外线辐照更加敏感; 仅仅缺失Lon蛋白酶结构域的耐辐射奇球菌表现为比radA突变体略微更抗γ射线和紫外线辐照处理. 这些实验结果表明, 耐辐射奇球菌RadA蛋白的确参与了DNA损伤修复过程, 而且不同的结构域具有不同的功能.     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

苜蓿根瘤菌1021外源cAMP上调glnⅡ及glnK-amtB的表达

苜蓿根瘤菌1021中多个腺苷酸环化酶基因的存在, 暗示着cAMP的重要性. 本研究用全基因组DNA微阵列分析了外源cAMP对苜蓿根瘤菌的功能. 分析结果表明, glnⅡ和glnK的转录水平在外源cAMP存在时有明显上调. 通过测定glnⅡ和glnK启动子与lacZYA报告基因融合系统在苜蓿根瘤菌体内的活性, 再次证实外源cAMP对glnⅡ和glnK启动子表达有激活作用.     

一个先天性小眼球家系致病基因的排除性定位

先天性小眼球是一种先天发育异常性眼科疾病. 通过基因扫描和连锁分析对一个6代常染色体显性遗传先天性小眼球中国家系的疾病相关基因进行研究. 根据已报道的与小眼球相关的5个基因座位(MITF, SOX2, PAX6, MCOP和NNO2), 在3, 11, 14和15号染色体上选取了14个微卫星标记, 以荧光标记引物的聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段, 用ABI 377 DNA遗传分析仪对该家系成员进行基因扫描和基因分型, 并采用Linkage软件包对基因分型结果进行连锁分析. 结果显示, 该家系致病基因与这些已报道的座位均不连锁, 即该家系致病基因不是已报道的座位, 可能是一个尚未报道的对眼球发育至关重要的新基因座位.     

阿维菌素B产生菌寡霉素合成阻断株的构建

以仅产阿维菌素(avermectin) B和寡霉素(oligomycin)的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)CZ8-73为出发菌株, 构建基因缺失载体pXL05(pKC1139∷ΔolmA1 + ΔolmA4), 并将其转入CZ8-73中, 通过缺失质粒和染色体之间的同源双交换, 对染色体上长达90 kb的寡霉素PKS基因簇(olmA)进行了缺失突变. 将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测, 发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分, 阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当, 说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成. 该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的, 不会发生进一步的重组, 因此突变株性状稳定, 在工业生产上具有应用价值.     

鸡生长激素基因单核苷酸多态与生长及屠体性状的相关性

以鸡生长激素(GH)基因作为控制鸡生长和屠体性状主基因的候选基因, 以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, 通过PCR-RFLP方法对GH基因进行多态性检测. 在该基因内含子3中发现1处碱基突变: G →A, 由内切酶EcoR Ⅴ酶切证实; 在内含子4中发现1处碱基突变: C→T, 由内切酶MspⅠ酶切证实, 并由此对F₂代鸡群个体进行基因型鉴定. 方差分析结果显示, 在内含子3中的碱基突变与腹脂性状显著相关; 内含子4中的碱基突变与腹脂、胸肉屠体性状显著相关, 但两处突变与其他大部分生长和屠体性状相关不显著, 结果表明鸡GH基因可能是控制某些屠体性状的主基因, 或与控制这些性状的主基因紧密连锁.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein, Bombyx mori, BmLSP)的调控序列, 涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区. 通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法, 以荧光素酶(luc)为报告基因, 构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒, 在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析. 结果表明, 含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍, 暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件. 上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用. 此外, 外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应, 低浓度处理增强启动子活性, 高浓度处理起抑制作用; 而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测

通过构建依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)的衣藻表达载体, 用石英砂VOTEX转化技术, 将phbB基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii cc-849)中, 用含有10 μg/mL的Zeomycin的平板培养基进行筛选和实验室保持培养, 得到了表达phbB基因的转基因藻株. PCR和Southern blot结果显示phbB基因已整合到莱茵衣藻基因组中. RT-PCR与DNA杂交的检测结果显示, 导入的phbB基因在衣藻中具有转录活性.     

水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为

将玉米的转座子系统Ac/Ds导入水稻基因组中诱导产生突变体的方法已成为构建水稻插入突变体库的主要策略之一. 本研究通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交, 构建水稻的Ac/Ds双因子转座系统, 对F₁~F₅代的Ds转座行为进行了研究. 通过转座检测, 发现1例Ds转座引起约170 bp T-DNA载体序列的缺失, 另1例Ds转座插入基因组时带有一段272 bp的T-DNA载体序列. 对F₁~F₅代Ds转座的连续检测结果表明, 配子体转座频率随世代的增加而提高, F3代的配子体转座频率达54.2%. 采用TAIL-PCR的方法扩增Ds元件旁侧的基因组序列, 对17个TAIL-PCR产物的序列进行了分析, 发现有5例Ds插入到基因序列中, Ds既可发生邻近位置的转座, 也可发生不连锁的转座, Ds在染色体间的转座频率为33.3%.     

番茄ACC合成酶基因Le-ACS6启动子的结构分析

乙烯对高等植物的生长发育具有重要的调控作用, 而Le-ACS6是控制番茄果实发育过程中第1系统乙烯合成的关键酶, 其基因表达受乙烯的负反馈调节. 利用5′系列缺失的Le-ACS6启动子与报告基因LUC的融合基因以微粒轰击法瞬时转化番茄果实, 发现Le-ACS6启动子中ATG上游-347 ~ -266区域可能含有与响应乙烯负调控相关的顺式作用元件. 分别以全长和缺失-347 ~ -266区域的Le-ACS6启动子与报告基因GUS构建融合基因, 利用农杆菌介导的方法稳定转化微型番茄Micro-Tom. 结果表明, -347 ~ -266区域缺失的Le-ACS6启动子所驱动的GUS表达不再受外源乙烯的抑制.