番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.     

西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆八氢番茄红素合成酶（PSY）基因的cDNA全长,用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,并用实时荧光定量PCR技术研究PSY在不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达情况.结果表明,PSY基因cDNA全长1 561 bp（GenBank登录号为KC166870）,其开放阅读框为1 266 bp,编码421个氨基酸.该基因及其推导的氨基酸序列与同为葫芦科的其他植物的PSY及氨基酸序列的同源性分别为87％和91％以上;序列分析显示,PSY氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列.不同瓤色西瓜果实发育过程中PSY的表达存在明显差异,红瓤果实中的表达量最高,这表明PSY可能与红瓤果实中积累较多的类胡萝卜素有关;PSY的表达量均高于PSY-A,推测PSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成.     

盐藻Psy基因保守序列的克隆及同源性分析

文中根据两种藻——Dunaliella bardawil和Haematococcus pluvialis的Psy cDNA保守序列以及6种植物——Arabidopsis thaliana，Oryza sative，Tagetes erecta，Lycopersicon esculentum，Capsicum annuum和Daucus carota的Psy基因氨基酸保守序列设计了上游引物5’-GAGTACGCCAAGACCTTCTA-3’和下游引物5’-GTTGTCATAGTCATTCTTCTC-3’．以盐藻基因组为模板、以46～35℃每循环递减0．5℃的退火温度扩增获得的大小约为2490bp的片段，经NCBI／BlastP同源性分析推测其为Psy基因的部分片段．     

欧文氏菌AEBL002菌株八氢番茄红素脱氢酶基因保守序列的克隆与同源性分析

从农田土训中分离筛选到一株产胡萝卜素菌AEBL002,提取基因组DNA,根据报告的八氢番茄红素脱氢酶基因设计PCR引物,对AEL002基因组DNA进行RCR扩增,扩增产物为一条大小约为800bp的DNA片段,在Genbank中对其进行同源性检索,发现该片段与Erwinia uredovora八氢番茄红素脱氢酶基因在732个碱基中有96．038％的一致性。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

SAM合成酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

采用PCR技术从S.cerevisiae TCCC 31012菌株的染色体DNA中扩增得到S-腺苷甲硫氨酸合成酶-2基因(sam2),将sam2克隆到酿酒酵母表达载体pACT2的强启动子PADHI控制下,以构建高效表达质粒,并在酿酒酵母亮氨酸缺陷型茵株YS58中表达.重组质粒经鉴定含有sam2基因.工程菌YS58-2表达产物经SDS-PAGE,结果显示重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子质量约为43ku,经凝胶电泳扫描,表达带约占菌体总蛋白的14%.YS58-2菌株培养72 h的SAM合成酶活力为16.5 U/mg茵体蛋白,较出发菌S.cerevisiae TCCC 31012提高了40.3倍,较受体菌YS58提高了32倍.     

牛蛙生长激素基因cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

以成体牛蛙脑垂体总RNA为模板进行RT-PCR,克隆到牛蛙生长激素基因(bullfrog growth hormone, bfGH)cDNA编码序列,其长度为651 bp,编码的前体GH蛋白序列经BLAST分析,与已报道的牛蛙GH蛋白质序列AAB24792、AAB19428、CAA31038的同源性分别为98.1%、96.3%、95.3%,其在Genbank的登录号为AY251538;将bfGH亚克隆到原核表达载体pGEX1-λt构建成牛蛙GH原核表达载体VGBfGH,转化BL21（DE3）E.coli得     

小鼠OB基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织中扩增了OB基因,并利用定向克隆技术克隆至原核表达载体pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot检测.表达产物利用亲和层析技术进行纯化.结果显示:表达的带有his标签的小鼠leptin融合蛋白,分子量约为20 ku.0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导2.5 h时,leptin融合蛋白的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上.表达产物经过纯化,纯度可达90%以上.Western-blot杂交显示,小鼠leptin融合蛋白有很强的抗原特异性.     

葛仙米中SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从葛仙米（Nostoc sphaeroides）总DNA中克隆了一段基因序列,该序列与基因库中已公布的编码普通念珠藻（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为98％,将该基因插入含T7启动子的质粒pET-32a（＋）中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用lmmol／L1PTG诱导表达数小时后,产生较多重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在,SDS-PAGE分析表明：在相对分子量约为22kd的位置有一条明显蛋白质带,将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2550U。     

人过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中获得高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x构建了融合表达载体并进行了表达。结果融合表达可获得可溶性蛋白,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因的克隆表达

大肠杆菌碱性磷酸酶是同二聚体金属酶，被phoA基因编码．采用PCR方法从大肠杆菌K12中扩增到碱性磷酸酶基因（phoA）．用限制性内切酶BamHI和HindⅢ将片段插入克隆载体pETBlue-2．该基因被重组、转化后在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，而后进行SDS-PAGE检测及紫外吸收分析测OD410．克隆得到了phoA基因并实现了蛋白表达，碱性磷酸酶的活性提高了18，3倍，为进行组织化学、免疫印迹、突变分析等工作打下了坚实的基础．     

Pseudomonas koreensis JDM-2株ACC脱氨酶基因的克隆和表达

应用PCR从杜仲内生Pseudomonas koreensis JDM-2株基因组中扩增出ACC脱氨酶基因acdS,将其克隆到pMD18-T载体并段进行DNA测序,通过BamHⅠ和HindⅢ酶切从重组质粒pMD18ACDS中切下acdS基因序列,将其连接到pQE30质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点,构建表达质粒pQE30ACDS,转化大肠杆菌BL21,利用比色法测定ACC脱氨酶活力.测序结果表明,JDM-2菌株acdS基因大小为1 017 bp,与已报道不同菌种acdS基因的同源性在86％～99％之间.SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中表达了分子量为38 kDa的ACC脱氨酶.酶活性检测结果显示重组菌ACC脱氨酶的酶活力为0.214 U/mg.     

大黄欧文菌中蔗糖异构酶基因的克隆表达及应用

以大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5基因组DNA为模板,PCR扩增得到编码蔗糖异构酶(SIase)的基因palⅠ,构建克隆载体pUC18-palⅠ。经测序正确后,将palⅠ亚克隆至表达载体pET-22b(+)上,并在E.coliBL21(DE3)中成功表达相对分子质量约为66 000的可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱对表达产物进行纯化,纯酶的比活为40 U/mg。转化条件研究表明:重组菌能够高效转化质量分数为50%的蔗糖溶液,转化液中异麦芽酮糖得率为85%。     

棒状杆菌亮氨酸操縱子在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pTZ22为载体,用HindШ限制酶切割谷氨酸棒状杆菌染色体DNA进行克隆。分离到带有亮氨酸操纵子的4.5kb片段。用Southern切口移位分子杂交检测,证明在4.5kb的片段中既包含有leuB基因,而且对leuA基因也表现同源性。     

粟酒裂殖酵母麦芽糖酶基因的克隆及在大肠杆菌内的表达

利用PCR的方法,以粟酒裂殖酵母菌的染色体DNA为模板,扩增得到粟酒裂殖酵母的结构基因,其开放阅读框1740 bp的序列,可以编码579氨基酸,分子量为67.7 kD.利用NCBI对它的蛋白序列进行比对,发现这个蛋白序列与Aspergillus oryza、Candida albicans、Hansenula polymorpha、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus的麦芽糖酶相比分别具有40.6%、41.6%、37.9%、34.7%、34.5%的相似性.而与粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶具有99.8%的相似性,由此可以得出克隆得到的结构基因应该是粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶结构基因.将克隆的粟酒裂殖酵母的麦芽糖酶基因克隆到pQE30表达载体中在大肠杆菌中进行诱导表达,然后测定其麦芽糖酶的活力,其酶的比活力是野生菌株的21倍,诱导条件下麦芽糖酶的比活力是非诱导条件下的10倍.     

大鼠肌肉素cDNA克隆及表达

通过RT-PCR方法从大鼠骨骼肌中克隆到肌肉素cDNA,构建表达载体pGEX-5X-3-musclin,并在BL21大肠杆菌中成功表达了融合蛋白GST-Musclin,且对表达条件进行了优化.在最优化的表达条件下,融合蛋白的表达量达到了14.2%.     

酵母α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中,重组质粒pRSET-Gal转化至相应的受体菌BL21（DE3)）PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析,在50kD处有一目的分子大小的亮带,裂解细菌后经X-α-Gal的显色底物反应,液体变蓝．试验表明：α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的。     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

在大肠杆菌中克隆类产碱假单胞菌基因启动子

类产碱假单胞菌 (Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ)是 1991年从重庆歌乐山林场自然病死的黄脊竹蝗(Ｃｅｒａｃｒｉｓｋｉａｎｇｓｕ)中分离到的一种新的病原菌 ,对多种草地蝗虫有较强的感染力[1] .近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白[2 ] 、安全性[3 ] 等方面进行了深入研究 ,证明该菌对蝗虫致病是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致 .该蛋白分子量为 2 5 10 0Ｄａ ,经研究表明 ,该菌无芽孢 ,本身具有较强的毒蛋白 ,故具有构建成为基因工程菌广泛用于生物防治的潜力 .我们采用启动子探针型载体 ｐＳＵＰＶ4 ,分离Ｐ…