空调冷却塔中军团菌的半巢式PCR检测方法研究

军团菌是军团菌病的病源,在空调系统中的冷却塔水中普遍存在. 对常德市区随机在14个冷却水塔取水样,通过半巢式PCR方法,扩增军团菌特异16srRNA基因成功地对水样进行检测,结果14个水样检出有军团菌,检出率为100%.     

新疆喀什、库尔勒及石河子地区维吾尔族妇女宫颈癌HPV16感染率对比

为探讨新疆喀什、库尔勒及石河子地区维吾尔族妇女宫颈癌患者中HPV16感染率的差异.采用半巢式PCR技术对152例维吾尔族妇女宫颈癌石蜡组织中HPV16DNA进行检测.结果显示在喀什、库尔勒及石河子地区妇女宫颈癌组织中,HPV16DNA检出率分别为80%,80%及53.1%,在统计学上有差异(x2=9.566,P=0.008);喀什及库尔勒地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16感染率高于石河子地区(x2=8.247,P=0.004;x2=5.906,P=0.015).因此,新疆喀什、库尔勒及石河子地区维吾尔族妇女宫颈癌患者中HPV16感染有所不同.     

新疆维吾尔族妇女宫颈癌中HPV16感染和p53蛋白表达的相关性研究

采用半巢式PCR法检测 80例新疆维吾尔族宫颈癌及 3 4例正常宫颈组织中HPV16DNA ,采用免疫组化法检测p5 3蛋白 ,分析其与宫颈癌发生的相关性 ,探讨HPV16感染和p5 3蛋白表达在新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生中的作用。结果显示 :HPV16检出率在宫颈癌中为 80 .0 % ,与对照组 8.8%相比 ,存在显著性差异 ( χ2 =4 9.88,P <0 .0 0 5 ) ;宫颈癌组织中p5 3蛋白表达阳性率为 6 2 .5 % ,也明显高于对照组 ,P <0 .0 0 5 ;p5 3蛋白表达与HPV16感染在统计学上无相关 ( χ2 =0 .0 ,P >0 .0 5 )。表明 :HPV16感染与新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生密切相关 ;HPV16感染的宫颈癌组织中p5 3蛋白表达有升高趋势     

单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ半巢式PCR检测方法的建立和在病毒性脑炎诊断中的应用

为进一步提高 PCR诊断方法的特异性和敏感性 ,在单纯疱疹病毒 ( HSV) TK基因区设计了一对外层公用引物和两个内层分型引物 ,建立了半巢式 PCR检测和分型 HSV的方法。用该方法检测了天津地区 64例病毒性脑炎患者 (病脑组 )和 4 6例其他中枢神经系统疾病患者 (对照组 )的脑脊液 ( CSF)标本。病脑组了阳性率为 1 5.63% ( 1 0 / 64) ,其中 9例为 HSV-1感染 ,1例为 HSV-2感染。对照组阳性率为 2 .1 7% ( 1 / 46)。本方法在发病后第 1天即可测出 CSF中的 HSV DNA,敏感性为 0 .0 1 TCID50 。     

检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的巢式PCR方法的建立与初步应用

根据GenBank中已发表的3株WSSV的VP28基因序列,设计了4条特异性引物．通过筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了检测克氏原螯虾WSSV的巢式PCR方法．该方法第一轮扩增的敏感性是36ng,第二轮扩增的敏感性是36Pg．在对9份克氏原螯虾临床病料的巢式PCR检测中,用引物W1和W2做第一轮扩增,未检测到阳性病例;用引物S1和S2做第二轮扩增,检测到一例WSSV阳性病例．以上结果表明：对于检测克氏原螯虾WSSV,巢式PCR较一步PCR具有更高的检测灵敏度和应用前景．     

乳腺癌患者外周血中MnSOD基因表达检测及其临床意义的研究

目的探讨锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)在乳腺癌患者和正常人外周血中的表达差异及其临床意义.方法采用实时荧光定量PCR方法检测218例乳腺癌患者和77例正常女性外周血中MnSOD基因表达水平,并进行分析.结果乳腺癌患者外周血中MnSOD基因表达水平为4.38±0.74,正常女性外周血中MnSOD基因表达水平为4.16±0.64,P0.001,有统计学意义.淋巴转移患者组和临床早期患者组与正常女性组比较,P0.001.结论淋巴转移和临床早期乳腺癌患者外周血中MnSOD基因表达水平显著低于正常女性,提示MnSOD的低表达与肿瘤的发生和发展有关.应用荧光定量PCR方法检测外周血MnSOD基因水平对监测乳腺癌有一定意义.     

雌激素和孕激素受体及P16蛋白在乳腺癌组织中表达与预后

目的探讨雌激素和孕激素受体及P16蛋白在乳腺癌组织中的表达与预后.方法选取行腺癌根治术并接受内分泌辅助治疗的原发性乳腺癌患者140例,免疫组化法检测乳腺癌组织中雌激素受体、孕激素受体、P16蛋白表达情况;收集患者年龄、月经情况、组织学分级、肿瘤直径、病灶分化程度、病理类型等临床病理指标;乳腺癌根治术后给予患者为期3 a的随访,记录生存情况.结果 140例乳腺癌患者组织中雌激素受体阳性58例(41.43%),孕激素受体阳性60例(42.56%),P16阳性82例(58.57%).不同年龄、月经状态、分化程度的乳腺癌患者雌激素受体、孕激素受体阳性率差异均具有统计学意义(P0.05).多因素Cox回归分析显示:年龄40岁、组织学分级Ⅲ期、低分化程度是乳腺癌患者生存率的独立危险因素;乳腺癌组织中雌激素受体阳性、孕激素受体阳性、P16蛋白阴性是乳腺癌患者生存率的独立保护因素.结论雌激素和孕激素受体及P16蛋白表达与乳腺癌患者预后明显相关,可用于内分泌辅助治疗预后的判断; P16基因可能参与调控乳腺癌内分泌辅助治疗的疗效.     

实时荧光定量PCR技术检测牙周炎致病菌中16S rRNA DNA探针的制备

利用实时荧光定量PCR和细菌16S rRNA测定技术制备牙龈卟啉菌染色体探针,并进行检测,为进一步研究牙周病可疑致病菌提供方法.主要方法是:厌氧环境下培养牙龈卟啉菌,抽提细菌DNA;根据基因库已知牙龈卟啉菌16S rRNA DNA序列,设计特异性的TaqMan探针和一对引物;经实时荧光定量PCR仪进行细菌DNA样本的PCR反应获得反应曲线.结果表明,细菌DNA样本经PCR反应后,在15个循环时,开始出现扩增曲线,此后荧光逐渐增强,在26个循环后达峰值.由此可见,利用细菌16S rRNA技术制备致病菌染色体探针,经实时荧光定量PCR测定,可以对目标微生物进行准确定性和定量.     

乳腺癌外周血中VEGF-C与癌组织中C-erbB-2蛋白的表达及临床意义

为探讨乳腺癌患者血清血管内皮生长因子C（VEGF-C）及癌组织中C-erbB-2蛋白表达的变化及其临床意义,采用ELISA法检测44例乳腺癌患者、44例乳腺增生患者血清VEGF-C含量,分析VEGF-C与临床指标的关系;用免疫组织化学法检测乳腺癌组织C-erbB-2蛋白表达。结果表明：1）血清VEGF-C乳腺癌组为227.95&#177;18.21pg/mL,良性病变组176.97&#177;11.23pg/mL,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;2）乳腺癌患者术前血清VEGF-C含量均值为277.95&#177;18.21pg/mL,术后1个月VEGF-C含量均值为212.45&#177;12.86pg/mL,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;3）VEGF-C含量与原发肿瘤分期相关,与有无同侧腋淋巴结转移无关;4）C-erbB-2蛋白在乳腺癌中的阳性表达率为45.50%,明显高于乳腺良性病变组织（11.00%）,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;5）乳腺癌同侧腋淋巴结转移组C-erbB-2蛋白的阳性表达率（70.00%）明显高于非同侧腋淋巴结转移组（37.50%）,两组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;6）血清VEGF-C含量随癌组织中C-erbB-2阳性强度增加而增加,两者呈正相关（r=0.826,P〈0.05）。上述结果显示,乳腺癌患者血清中VEGF-C含量可能成为鉴别乳腺良恶性病变的辅助指标之一;C-erbB-2与乳腺癌淋巴结转移有关;在乳腺癌的淋巴转移途径中VEGF-C可能与C-erbB-2存在着协同作用。     

烟叶中曲霉菌含量的荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为快速准确地对仓储烟叶中的曲霉菌含量进行测定,通过对几种曲霉菌的ITS区基因序列比对找出曲霉菌属遗传保守序列,以此为靶序列设计特异性引物及Taqman探针,构建烟曲霉基因序列重组质粒为阳性标准品,并绘制标准曲线,建立了烟叶中曲霉菌含量荧光定量PCR检测方法并验证该方法具有较好的特异性、灵敏度及重复性.利用此方法对模拟霉变烟叶进行跟踪检测,结果表明：当烟叶中曲霉菌基因拷贝数在10⁹～10¹¹copies·g^-1之间时,烟叶处于临近霉变的状态;大于10¹¹copies·g^-1时烟叶为霉变状态;小于10⁹copies·g^-1时烟叶则为未霉变状态.该研究以期为仓储烟叶的霉变情况监控提供了一种更为高效灵敏的检测方法.     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体,为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响,设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中,构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA;建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明,已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

人乳头瘤病毒HPV16E6的表达促进角质生成细胞凋亡的发生

为探讨HPV16早期基因E6的表达对角质生成细胞NIKS凋亡表型的影响及可能的机制,经培养稳定表达HPV16E6的角质生成细胞NIKS;使用不同的DNA损伤剂处理转染后细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况;建立表达HPV16E6突变体Y54D及F2V的p53降解缺陷型NIKS细胞系并用DNA损伤剂处理,流式细胞术检测凋亡情况.研究显示,流式细胞术结果显示稳定表达E6的细胞系在足叶乙甙、丝裂霉素及紫衫醇处理后发生明显的细胞凋亡;表达Y54D或F2V的NIKS细胞经DNA损伤剂处理后凋亡明显低于正常E6表达细胞.研究表明,人乳头瘤病毒E6的表达能够促进角质生成细胞凋亡的发生,这种促凋亡作用与细胞内p53的表达相关.     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPVl6E6蛋白

目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPVl6E6蛋白.方法 将HPVl6E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTB),然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的 基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,westem-b10t分析鉴定表达蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达.     

宫颈癌中CALCA基因甲基化与HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系

 选择HPV16 阳性宫颈癌细胞和RNAi 技术,研究CALCA 基因甲基化与HPV16-E7 致癌蛋白表达的依存关系。构建慢病毒siRNA 重组表达载体,建立稳定表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型。以SiHa 细胞和RNAi 细胞模型的基因组DNA 为对象,选择CALCA 基因启动子区富含CpG 岛屿的目标片段,使用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）筛查分析,研究RNAi 抑制HPV16-E 7 表达后,CALCA 基因甲基化状态的可逆性程度。选出CALCA 基因启动子区富含CpG 位点的目标片段,其大小为365 bp,含有19 个CpG 岛屿,发现其中13 个CpG 位点的胞嘧啶在SiHa 细胞基因组DNA 中发生了甲基化（13/19）,而在表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型中,所有CpG 位点的甲基化已发生逆转（0/19 位点）。本研究从细胞水平证明了宫颈癌细胞内的CALCA 基因启动子高甲基化对HPV16-E7 致癌蛋白表达有依赖性,为进一步研究E7 蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

HPV16E7-HSP70 Hybrid DNA Vaccine Induces E7-Specific Cytotoxic T Cells and Antitumor Immunity

0 IntroductionInbroicguhltat einxpge cDtaNtiAonvafcocri nper eivse ant ninegw aanpdp cruoraicnhg wdiits-heases . Due to the comparative weakness of cellulari mmunity that is purely induced by E7 DNA vac-cine,research on DNA vaccine is now focused onhowto enhance the i mmunogenicity of DNA vac-cine.It has been found in some research that thestrength of cellular i mmunity activity has things todo with the speed of antigen molecules’degrada-tion,i .e.the faster the degradation,the higher th…     

HPV16/18型原位杂交检测在子宫颈液基细胞学中的应用价值

目的:评价薄层液基细胞学及HPV16/18型原位分子杂交检测在子宫颈病变中的应用价值。方法:应用薄层液基细胞学技术及HE染色对112例患者行子宫颈脱落细胞学检查,按照TBS(theBethesda report system)细胞学分类标准分类:无上皮内病变或恶性病变(negative for introepithelia or ma-lignancy,NILM),意义不明确的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US)、低度鳞状上皮内病变(Low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高度鳞状上皮内病变(High-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL),鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)。同时应用原位分子杂交方法对样本进行HPV16/18型检测。结果:①在112例细胞涂片中,NILM:16例(14.3%);炎症病变:26例(23.2%);ASC-US:44例(39.3%);LSIL:25例(22.3%);HSIL:1例(0.89%);②112例细胞涂片中HPV16/18型阳性率随着子宫颈病变加重而增高,NILM及炎症、ASC-US、LSIL及HSIL各组间相比,NILM及炎症病变组与LSIL及HSIL组之间表达差异有统计学意义(P<0.05);③对5例细胞学HPV16/18型胞浆阳性病例的子宫颈活检标本进行HPV原位杂交对照检查,结果显示细胞核均呈阳性。结论:子宫颈液基细胞学联合HPV16/18型原位分子杂交检测有助于发现HPV感染引起的子宫颈病变;HPV16/18型细胞涂片中胞浆阳性染色,可作为细胞学检查HPV阳性的判定指标。     

新疆维、汉民族乳腺癌中P53和Ki-67蛋白表达及其意义

用免疫组化Envision法检测125例维、汉民族乳腺癌中P53及Ki-67蛋白的表达。结果表明，P53及Ki-67蛋白在乳腺癌中的阳性表达率明显高于非癌组织；且在浸润性导管癌中P53和Ki-67蛋白阳性表达与分级、转移呈正相关，与民族无关。随组织学分级增高，P53及Ki-67阳性表达增高。淋巴结转移者P53及Ki-67蛋白阳性表达明显高于无淋巴结转移者。提示P53和Ki-67蛋白阳性表达可能在乳腺良性病变恶性转化及乳腺癌的发生中具有重要作用，有可能成为临床预测预后的重要指标之一。     

快速敏捷检测人乳头瘤病毒基因型的实时荧光PCR方法

宫颈癌是女性最常见的一种恶性肿瘤,研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关.采用实时荧光PCR技术对引起宫颈癌的两种主要HPV亚型HPV16和18型阳性质粒进行检测,在实验室中成功构建了HPV16和18型的检测体系以及体外模拟的双重感染检测体系,并对三例临床确诊为宫颈癌的标本进行实时荧光PCR验证检测,确定三例标本均为高浓度HPV16型感染,极易引起宫颈癌变,与医院诊断结果相符合.本实验为实时荧光PCR技术检测HPV16和18型的临床检验在实验室中成功地进行了探索,为实时荧光PCR技术在宫颈癌大规模筛查上的应用提供了研究基础.