A general method for site-directed mutagenesis in prokaryotes

The genetic analysis of genes from prokaryotic species for which experimental genetic systems have not yet been developed is often limited by the difficulty of producing mutations in those genes. We report here a general technique applicable to Gram-negative prokaryotes for site-directed mutagenesis of cloned DNA fragments which we have applied to the study of the symbiotic nitrogen fixation genes of Rhizobium meliloti. In particular, we mutagenized cloned R. meliloti restriction fragments in Escherichia coli with transposon Tn5 and then replaced the wild-type parental DNA sequences with the mutant DNA sequences in the R. meliloti genome. Using this method we show that an R. meliloti DNA restriction fragment, cloned previously on the basis of homology to Klebsiella pneumoniae nif genes, contains gene(s) essential for symbiotic nitrogen fixation. In addition, we use this method to construct a physical genetic map of a subset of the R. meliloti nif genes.     

一种快捷可靠的大肠杆菌重组质粒筛选方法

针对如何大规模地筛选大肠杆菌重组子,将质粒快检和菌落PCR两种方法巧妙地融合,建立一种新的高效快捷的重组质粒筛选方法.该方法不需接种抽取质粒,在转化子长出当天即可筛选到重组质粒.大规模基因克隆表明该方法能够快速、准确地筛选出阳性克隆.     

DS 9701菌株的紫外诱变及PHB解聚酶高产菌株的筛选

以青霉(Penicillium.sp)DS 9701为出发菌株,通过紫外线诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶培养复筛的方法,获得一突变株,编号DS 9701-M 09.该突变株的PHB解聚酶活力是原始菌株的2.3倍,经传代培养,该菌株的PHB解聚酶高产特性稳定遗传.     

酿酒酵母的连续复合诱变及其突变株的快速筛选

为了获得高产的工业用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株,利用己烯雌酚(DES)和UV对酿酒酵母菌QD进行连续复合诱变,采用改进的发酵小管集气法结合乙醇定量测定来进行突变株的筛选,并与常规复合诱变及筛选方法进行比较.结果表明:连续复合诱变的正向突变率最大值为18.9%,与常规诱变方法的最大正向突变率15.6%相比提高了21.2%,说明运用该诱变方法能获得较高的正向突变率;改进的筛选方法可以快速筛选出目的突变株,同时,获得了一株高产乙醇的突变株,在甘蔗汁发酵培养基中其乙醇产量达到9 720 mg/100 mL,比常规诱变方法筛选到的突变株乙醇产量(9 170 mg/100 mL)高出6.0%;与常规诱变方法相比,连续复合诱变方法不仅能够得到较高的正向突变率,而且能够获得更加高产的突变株.     

Accurate prediction of the stability and activity effects of site-directed mutagenesis on a protein core.

Theoretical prediction of the structure, stability and activity of proteins, an important unsolved problem in molecular biology, would be of use for guiding site-directed mutagenesis and other protein-engineering techniques. X-ray diffraction studies have provided extensive structural information for many proteins, challenging theorists to develop reliable techniques able to use such knowledge as a base for prediction of mutants' characteristics. Here we report theoretical calculation of stabilization energies for 78 triple-site sequence variants of lambda repressor characterized experimentally by Lim and Sauer. The calculated energies correlate with the mutants' measured activities; active and inactive mutations are discriminated with 92% reliability. They correlate even more directly with the mutants' thermostabilities, correctly identifying two of the mutants to be more stable than the wild type.     

莱茵衣藻玻璃珠法快速转化检测体系的建立

为了建立在衣藻中快速简便研究外源基因功能的方法,采用玻璃珠转化法将pBI221质粒（35S,Amp,GUS）高效转化至细胞壁缺陷型衣藻品系CW-15（Arg-）,通过对转化条件及GUS表达检测条件摸索,发现35S启动子在CW-15中能有效启动GUS表达,且GUS最佳检测时间约为转化后24h,重组细胞先染色后制片更有利于GUS检测.     

微波辐照选育L-乳酸高产菌的生物学特性研究

在低功率微波条件下,采用水循环冷却器,对干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus)X1-12进行诱变处理,在微波功率400 W,辐照时间3 min的诱变条件下得到L-乳酸产量为115.8 g/L的突变株W3-9,比原始菌株X1-12提高了57.98%,连续遗传8代,产酸性状稳定.通过原始菌株和突变株的生理生化实验,可知微波辐照后的菌株生物学特性发生部分改变.     

考虑波束限制的改进导航星座星间链路方案

导航卫星星座系统由于卫星间的相对运动使卫星的相互可见关系不断变化,这给链路选择带来了挑战.本文研究具有同轨及异轨星间链路的导航星座网络,综合考虑星间链路状态,通过比较最短路径方案和K短路径方案,提出了一种考虑波束限制的适用于导航卫星星座的星间链路优化方案,并进行仿真研究,最后得出了有用的结果.     

一种简便快速筛选重组子的方法

将转化后的单菌落置于快检缓冲液中,振荡后,直接通过琼脂糖凝胶电泳比较质粒大小,2h内可筛选出重组子．详细介绍了快检缓冲液配方、快检效果、注意事项以及与其它方法的优势比较．     

圆形地下连续墙场地动力反应分析的子结构方法

利用子结构方法对某超大直径圆形地下连续墙场地进行了动力反应分析.介绍了子结构分析方法的基本原理,探讨了主自由度节点的一般选取原则.采用等效线性化方法考虑土体非线性性质,并运用ANSYS参数化设计语言编制了场地土层模型的子结构方法计算分析程序.建立圆形地下连续墙场地计算模型,分别采用3种主自由度节点选取方法对其进行了动力计算分析.通过对比子结构方法和整体方法计算结果,验证了子结构分析计算方法的合理性及有效性.数值分析结果表明,若合理地选择主自由度节点,采用子结构方法可以在保证计算精度的基础上极大地提高计算效率.     

CFRP加固带裂缝双向板的计算及有限元分析

针对工程实例中钢筋混凝土双向板出现裂缝的问题,提出碳纤维布（CFRP）加固方法,给出CFRP用量的计算公式,并根据该加固方法,利用有限元软件ANSYS建立了带裂缝的钢筋混凝土双向板的有限元模型,分别分析了未开裂、开裂及加固后双向板的受力状态,验证了加固效果。结果表明：对挠度的加固效果η=5.3%,对vonmises应力的加固效果η=20.2%,CFRP加固双向板对承载力的加固效果优于刚度。     

能量集成改造的全局夹点分析法

考虑全局中各个过程之间以及与公用工程之间的相互影响，扩展夹点分析法于全局系统，提出了一种系统的全局能量集成改造方法。用该方法可进一步节省燃料或增加联产功，并应用实例证明了它的有效性。     

大引物PCR定点突变方法的改进

对大引物PCR定点突变方法进行改进,主要包括：避免在一个PCR反应中同时使用扩增全长基因的常规引物,选择不同载体克隆原始基因和突变基因,通过抗性选择筛选突变子,从而完全避免原始基因的干扰．实验结果证明利用改进后的方法进行基因点突变,可以减少操作步骤,提高突变频率．     

基于内梅罗指数法构建的评价因子筛选和优化方法

为获取专项评价中的关键性评价因子和提高单因子评价标准的区域适用性,提出了一种基于内梅罗指数法构建的筛选和优化方法。以建立的单因子指数法和内梅罗指数法评价结果表为基础,通过确定质量类别和计算非零结果数,获得评价因子排序;再以排序为参照,通过优化单因子的评价标准,提高两种方法评价结果的一致性。以东营广饶县海水入侵评价为例,对该方法进行实例应用研究,结果表明,钠吸附比是广饶县海水入侵评价的关键性评价因子。评价标准经过优化后,单因子指数法与内梅罗指数法评价结果的一致性比例均有不同程度的提高,其中,氯化物优化效果最为显著,与之前相比提高了21.7%。该方法可为某些特定目标的修复和改善以及跟踪性或周期性评价提供针对性更强的技术支持。     

五阶色散方程的一类交替分组方法

给出了五阶色散方程的一类具有并行本性的交替分组方法,这种方法是无条件稳定的,能直接在并行计算机上使用.数值试验表明,这种方法有很好的精度.     

一类混合时滞系统对时滞参数的自适应控制

研究了一类较为复杂的混合时滞系统——被控状态为连续形式且状态时滞参数未知,而控制输入为离散序列.在分别建立了连续与离散的模型基础上,根据已有的混合系统的稳定性定理及一种Lyapunov-Krasovskii泛函方法,提出了一种镇定系统的方法,并得到了离散形式的可用于控制输入的对未知时滞参数的自适应律.在该自适应律作用下,未知时滞参数能始终反映在带记忆状态反馈控制器中,依赖于时滞的反馈控制器存在的充分条件可通过一组线性矩阵不等式(LMIs)表示.     

地表水水质评价模型及其遗传算法求解

以标准等级水体为样本点构造样本空间,借鉴无单元思想,建立带权的地表水水质评价模型.对模型中的参数,根据数据拟合的思想,将问题转化为一个非线性优化问题,然后利用遗传算法进行求解.用已知算例对评价模型的合理性进行对比检验,并将其成功应用于密云水库样本点水质的综合评价,最后将此模型推广到一般情形的评价问题.     

一类线性规划的调节熵函数法

目的为得到一类线性规划的简单有效的数值算法。方法通过利用熵函数的思想，给出了求解该类线性规划的调节熵函数法，由于算法是基于等价的极大极小问题，从而具有初始点任意性的优点。结果给出了该算法分析并讨论了它的收敛性，最后给出的数值例子显示了其有效性。结论与传统方法比较，所得算法更为简洁，具有可充分利用现有无约束优化算法，以及可较快地收敛到问题的最优解等特点。     

使用Excel软件求取反应级数的快速方法

通过引入与初浓度相关浓度的相对偏差平方和P求取极小值,使用Excel软件的规划求解功能处理反应动力学方程的积分式,无需编程即可快速求取任意反应级数。