嗜水气单胞菌蛋白质组分子解剖图谱的初步建立

采用蛋白质组学技术,建立了嗜水气单胞菌PPD(134/91)在稳定期的蛋白质组分子解剖图谱.将嗜水气单胞菌接种于LB培养基28℃培养18h,取菌总蛋白进行2 DPAGE.从2 DPAGE图谱中随机选取124个蛋白质点进行肽质量指纹图谱鉴定,检索发现其中10个确定为数据库中收录的嗜水气单胞菌的基因或蛋白,其比例约为1/12.实验结果对嗜水气单胞菌菌株之间的比较研究和功能蛋白质组研究具有重要参考价值.     

嗜水气单胞菌毒力与毒力基因分布的相关性

采用PCR扩增的方法对9株鱼源嗜水气单胞菌AEROM ONAS HYDROPHILA中的气溶素基因(AERA)、溶血素基因(HLYA)和丝氨酸蛋白酶基因(AHPA)进行了扩增。结果表明,6/9的A.HYDROPHILA中存在AERA基因,8/9的A.HYDROPHILA中存在HLYA基因,而在7/9的A.HYDROPHILA中检测到AHPA基因。通过比较基因检测的结果与嗜水气单胞菌对鲫鱼的致病性,发现AHPA阴性菌株是无毒株,强毒株都呈AERA HLYA AHPA 基因型。AERA HLYA AHPA 基因型是致病性嗜水气单胞菌主要的基因型。本研究首次发现AHPA阳性的嗜水气单胞菌皆为毒力菌株,并且发现AERA和AHPA基因存在相关性,探讨了嗜水气单胞菌致病性与毒力基因分布的关系。     

嗜水气单胞菌与其拮抗菌R-15的生长曲线研究

嗜水气单胞菌的拮抗菌R-15经鉴定为粘质沙雷氏(Serratia marcescens Bizic).研究嗜水气单胞菌及其拮抗菌的生长曲线以及R-15菌与嗜水气单胞菌混合培养的生长曲线,分析拮抗菌R-15培养时间与其产拮抗活性物的关系,并对发酵液中拮抗活性物作初步分离.结果表明,拮抗菌R-15液体培养在20 h时菌体数量达最高,抑菌作用在36 h时最强;当两种菌混合培养至24 h后,嗜水气单胞菌数量从4.5×1017/mL开始快速下降至62 h的2.6×107/mL,而拮抗菌R-15仍维持较高水平.拮抗活性物质初步确定不是蛋白类物质.     

中华鳖嗜水气单胞菌的生物学特性

以T3菌株为代表菌株对中华鳖嗜水气单胞菌的生物学特性进行初步研究。对中华鳖嗜水气单胞菌的培养特性比较发现：本菌在鲜血琼脂和TSA固体培养基上生长较好,在TSB液体培养基和BHI液体培养基中生长较好;测定中华鳖嗜水气单胞菌在TSB液体培养基中的生长曲线表明：培养16～20h活菌数达到最高峰,24h后活菌数大幅下降,这一生长规律为中华鳖嗜水气单胞菌的大规模培养奠定了基础;中华鳖嗜水气单胞菌在生理盐水、磷酸盐缓冲液和TSB液体培基中4℃保存的存活曲线表明：本菌在以上介质中前期不易死亡,后期死亡较快。并利用分光光度计测定法解决了该菌即时计数的问题,为中华鳖嗜水气单胞菌的动物实验的开展奠定了基础,本研究测定了该菌对中华幼鳖和银鲫的致病性,其LD50分别为8．40×10^8CFU和8．63×10^8CFU．     

一株嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的16S-23S rDNA间区序列分析及应用

根据细菌的16S rDNA 3'端和23S rDNA 5'端的高度保守区设计引物,扩增了一株中华鳖Trionyx sinensis"红板病"病原菌--嗜水气单胞菌的16S-23S rDNA间区,克隆到pGEM-T载体上,测序.用BLAST和DNAstar软件对16S-23S rDNA间区序列以及其内tRNA基因与已发表的嗜水气单胞菌和近缘种的IGSG序列进行比较分析,设计出对嗜水气单胞菌特异的PCR引物,建立了检测嗜水气单胞菌的PCR方法,进行了特异性、灵敏性检测,并用此方法检测了不同的水样.     

嗜水气单胞菌的分离培养及鉴定

从患腹水病褐牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化鉴定方法对该菌进行了鉴定.根据Genbank 上报道的嗜水气单胞菌标准株的16s rDNA序列以及致病性嗜水气单胞菌所含有的气溶素(aer)基因没汁了2对引物,对所分离到的2株疑似菌以及3株标准株进行PCR扩增,均能够扩增出目的条带,经测序后,该菌的16s rDNA的序列、aer序列与标准株同源性分别达到99.8%和95%,与常规细菌鉴定方法所得结果一致,证明该菌为嗜水气单胞菌.     

我国嗜水气单胞菌感染研究概况

主要从嗜水气单胞菌感染的发现、人的嗜水气单胞菌感染、动物的嗜水气单胞菌感染、诊断要点及防控等方面对我国嗜水气单胞菌感染进行了综述。     

卵黄抗体在防治中华鳖气单胞菌病中的应用

探讨了卵黄特异性抗体在防治中华鳖气单胞菌病中的应用 .产蛋鸡经嗜水气单胞菌免疫后 ,产生了高效价的卵黄抗体 ;冻干过程中抗体活性基本没有损失 ;体外抑菌试验表明 ,该特异性抗体具有较强抑制嗜水气单胞菌的效果 ;鳖场被动免疫防治试验证明 ,该抗嗜水气单胞菌卵黄抗体对中华鳖气单胞菌病具有良好的防治效果 .     

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术(SELEX,system evolution of ligands by expo-nential enrichment),利用体外合成的长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力.研究结果表明:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A(absorbance)值逐渐增加,亲和力由最初的0.32升到第9轮的0.72.研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础.     

双重PCR法快速检测欧鳗鲡嗜水气单胞菌

采用已知的嗜水气单胞菌编码溶血素(Hemolysin)和外膜蛋白(Ompts)的基因序列为目的基因,依据其保守序列设计两对相应引物,用双重PCR方法检测了32株从发病欧鳗鲡分离的细菌,将检测结果与试剂盒快速生化鉴定结果进行比较.以嗜水气单胞菌为阳性对照,以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌为阴性对照检测了嗜水气单胞菌溶血素与外膜蛋白基因的特异性.结果表明:被检测的32株欧鳗鲡致病菌中,检测到的4株既有溶血素基因又有外膜蛋白基因的细菌,其生化鉴定结果全部为嗜水气单胞菌,而仅具有外膜蛋白基因的13株细菌中只有5株生化鉴定结果为嗜水气单胞菌.证明双重PCR法可用于快速检测部分嗜水气单胞菌.     

Integration of rolling circle amplification and cationic conjugated polymer for the homogeneous detection of single nucleotide polymorphisms

A novel, homogeneous and sensitive assay for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) by integration of rolling circle amplification (RCA) and cationic conjugated polymer (CCP) has been developed and tested. Mutant DNA serves as the template for specifically circularizing a padlock probe (PLP) with a sequence that is complementary to the mutant DNA. Afterwards, the mutant DNA directly acts as the primer to initiate the RCA reaction in the presence of phi29 DNA polymerase that generates a long, tandem single-strand DNA product. During the RCA reaction, fluorescein-labeled dUTPs are incorporated into the RCA products. When the CCP is introduced, efficient FRET from CCP to fluorescein occurs as a result of the strong electrostatic interactions between the CCP and the DNA produced by RCA. The wild-type DNA contains a single base mismatch with PLP with the result that the PLP is not circularized, RCA is not triggered and inefficient FRET results. By measuring the change of the emission intensities of CCP and fluorescein, it was possible to detect the SNP in a homogeneous manner. The method is sensitive and specific enough to detect 0.1 pmol/L mutant DNA and to determine a mutant allele frequency as low as 2.0%.     

猪多杀性巴氏杆菌(PM)PCR诊断技术的建立

参照文献报道的猪多杀性巴氏杆菌（PM）基因组的部分序列,设计合成引物,建立了PM的PCR诊断技术,并对各反应条件进行优化.本实验建立的PM的PCR扩增片段大小为457 bp.以建立的PCR方法对临床送检的可疑病猪的肺部病料进行了特异性检测和敏感性试验及生化鉴定.结果表明PCR检测阳性结果与猪多杀性巴氏杆菌的形态染色、培养特性和生化鉴定结果一致,该PCR方法在临床诊断中具有应用价值.     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 快速检测方法的建立与应用研究

摘要: 目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA 基因设计特异性引物和探针,构建含有HA 基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN 线性范围达10 个数量级( 100—109 拷贝) ,最低检测限度为4 拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCＲ 和测序进行确证。整个检测过程可在2 h 内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

小鼠巨细胞病毒PCR 诊断方法的建立及其应用

摘要: 目的建立小鼠巨细胞病毒( MCMV) PCR 检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI 公布的巨细胞病毒设计引物,进行PCR 体系优化、敏感性、特异性测试; 运用优化后的方法,对87 份小鼠血清进行检测,对阳性样本进行测序分析。结果建立的小鼠巨细胞病毒PCR 方法灵敏度高,特异性好,初步检测4 个屏障设施的87 份小鼠血清, 13 份为阳性,通过测序证实为小鼠巨细胞病毒,验证了此方法的可行性。结论为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法。     

一个新的水稻GST类似蛋白基因XIG的克隆与分析

根据编码一种玉米GST类似蛋白的mRNA In2-1序列设计引物，以水稻cDNA文库为模板，PCR扩增得到一条270bp的DNA片段，以此片段为探针分别筛选水稻根cDNA文库及水稻基因文库，获得一条全长cDNA及其相应的全长基因，并通过测序得到了两者的全序列，该基因编码的蛋白具有GST的典型特征，在水稻中尚未见报道。     

鳗鲡病原性气单胞菌AFLP分型研究

以32株从养殖鳗鲡分离的病原性气单胞菌为试验材料,采用Biolog自动菌鉴系统对其进行生理生化鉴定,结果表明,有20株被鉴定为嗜水气单胞菌,7株被鉴定为威隆气单胞菌,1株为豚鼠气单胞菌,其余4株未能鉴定到种.为进一步确定20株嗜水气单胞菌和7株威隆气单胞菌的基因型,筛选了2对引物(E-C/M-C,E-C/M-A)分别对这两个菌种进行了AFLP分析.结果表明:20株嗜水气单胞菌中共检测到88个位点,均为多态性位点;7株威隆气单胞菌中共检测到61个位点,其中60个为多态性位点.经UPGMA聚类分析表明:20株嗜水气单胞菌可初步分为3种类型,每种类型之间平均遗传距离为0.449,同一类型内不同菌株的平均遗传距离为0.127;7株威隆气单胞菌可初步分为4种类型,每种类型之间平均遗传距离为0.467,变异范围为0.415～0.525.该结果为鱼类病原菌的DNA分型研究提供了参考.     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

免疫PCR技术的策略

免疫PCR是一种新兴的免疫标记技术，具有高敏感性和特异性的特点．本文对免疫PCR的方法、DNA标记探针的构建及扩增产物的检测进行了综述．     

An easy-to-use site-directed mutagenesis method with a designed restriction site for convenient and reliable mutant screening

Site-directed mutagenesis (SDM) has been a very important method to probe the function-structure relationship of proteins. In this study, we introduced an easy-to-use, polymerase chain reaction (PCR)-based SDM method for double-stranded plasmid DNA, with a designed restriction site to ensure simple and efficient mutant screening. The DNA sequence to be mutated was first translated into amino acid sequence and then the amino acid sequence was reversely translated into DNA sequence with degenerate codons, resulting in a large number of sequences with silent mutations, which contained various restriction endonuclease (RE) sites. Certain mutated sequence with an appropriate RE site was selected as the target DNA sequence for designing a pair of mutation primers to amplify the full-length plasmid via inverse PCR. The amplified product was 5′-phosphorylated, circularized, and transformed into an Escherichia coli host. The transformants were screened by digesting with the designed RE. This protocol uses only one pair of primers and only one PCR is conducted, without the need for hybridization with hazardous isotope for mutant screening or subcloning step.