一种枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌的颉颃作用研究

通过液态颉颃培养法和琼脂扩散法,研究枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌在不同浓度比例和时间维度上的颉颃作用,并确定最适宜的菌种用量。试验结果显示,枯草芽孢杆菌对副溶血弧菌有明显的颉颃作用,且枯草芽孢杆菌浓度越高,颉颃作用越明显。液态培养法中枯草芽孢杆菌与副溶血弧菌比例为100:1时最为明显,4 h抑菌率可达100%;比例为1:1时24 h后抑菌率稳定保持在80%以上。琼脂扩散法结果显示当枯草芽孢杆菌与副溶血弧菌比例大于等于1时会产生明显的抑菌圈,且抑制作用稳定持久。基于对枯草芽孢杆菌添加成本的考虑得出,不同时段枯草芽孢杆菌最适使用浓度不同。4 h内投放枯草芽孢杆菌最适浓度比为50:1;8 h内投放最适浓度比为10:1;8 h后间歇性投放浓度比为1:1的枯草芽孢杆菌。     

双重PCR法快速检测欧鳗鲡嗜水气单胞菌

采用已知的嗜水气单胞菌编码溶血素(Hemolysin)和外膜蛋白(Ompts)的基因序列为目的基因,依据其保守序列设计两对相应引物,用双重PCR方法检测了32株从发病欧鳗鲡分离的细菌,将检测结果与试剂盒快速生化鉴定结果进行比较.以嗜水气单胞菌为阳性对照,以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌为阴性对照检测了嗜水气单胞菌溶血素与外膜蛋白基因的特异性.结果表明:被检测的32株欧鳗鲡致病菌中,检测到的4株既有溶血素基因又有外膜蛋白基因的细菌,其生化鉴定结果全部为嗜水气单胞菌,而仅具有外膜蛋白基因的13株细菌中只有5株生化鉴定结果为嗜水气单胞菌.证明双重PCR法可用于快速检测部分嗜水气单胞菌.     

人溶血磷脂酸受体2基因的克隆及其在293T细胞中表达

在以前的研究中我们发现溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)通过溶血磷脂酸受体2(Lysophosphatidic acid receptor 2,LPAR2)介导促进胃癌细胞迁移.为进一步研究LPAR2介导的信号转导机制与功能,本研究试图建立过表达的LPAR2转基因细胞模型.选用人胃癌SGC-7901细胞系的cDNA经RT-PCR法克隆得到LPAR2基因CDS区,并亚克隆到pMD19-T载体,通过测序确认后、经酶切、连接到表达载体pIRES2-EGFP,酶切和测序鉴定获得pIRES2-EGFP-LPAR2重组质粒;通过LipofectamineTM2000介导把表达载体质粒转染进293T细胞.Western Blot法检测结果说明人LPAR2蛋白在293T细胞中得到表达.     

见血青总皂苷体外溶血与抗氧化活性研究

利用溶血与凝聚检查法检测见血青总皂苷体外溶血活性, 以及用DPPH自由基法、水杨酸法、邻苯三酚自氧化法研究其体外抗氧化活性.实验结果显示: 总皂苷在012~06 mg/mL范围内未表现出溶血作用, 但出现了红细胞凝聚现象; 对DPPH自由基的清除率与BHT相当, 其IC50值为017 mg/mL; 对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率较Vc弱, 且在0025~0475 mg/mL浓度范围内变化不大.     

检测海洋弧菌的酶联免疫吸附试验研究

研究建立中国对虾病原菌－副溶血弧菌的间接酶联免疫吸附试验快速检测技术，间接ＥＬＩＳＡ技术中的副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔ＩｇＧ用碱性磷酸酶标记，酶的底物为对磷酸基硝基苯。将该技术标准化后，测定了抗血清与１３株其它副溶血弧菌菌株２９株其它弧菌标准菌株的交叉反应，并进行了苗期对虾样品中副溶血弧菌的检测。     

应用红细胞光敏模型评价抗光敏中药添加剂

 研究了紫外线或光敏药物单独存在的条件下以及不同照射时间和不同药物浓度条件对模型的影响。建立了长波紫外线诱导光敏药物致使红细胞溶血模型,通过检测红细胞损伤后上清液中的血红蛋白含量,计算溶血率,从而反映细胞损伤程度。结果表明,紫外线低剂量或氯丙嗪单一条件存在时,并不能引起红细胞溶血;当氯丙嗪含量为0.33mg/mL,紫外线照射30min可致红细胞50%溶血,照射60min可使细胞100%溶血。应用此模型对10种中药及植物成分进行检测,筛选出银杏叶提取液、茶多酚和葡萄籽提取液3种具有抗光敏功能的活性成分。其中,银杏叶中主要成分黄酮类物质通过广泛的紫外吸收能力从源头阻止紫外线对细胞膜的损伤,茶多酚、葡萄籽中的多酚类物质通过清除自由基等光产物对细胞膜起到保护作用。     

溶血标本对临床生化检验结果的影响

探讨溶血血液标本对免疫球蛋白及心肌酶谱五项生化检验结果的影响。选择健康体检的血液标本60份,在溶血前和溶血后分别进行10项生化项目测定,比较检测结果。免疫比浊法测定的IgG、IgM、C3、C4在血液溶血前、后没有发生明显变化(P0.05),仅对IgA有一定的影响(P0.05)),心肌酶谱五项AST、LDH、CK、CK-MB、HBDH在血液标本溶血前、后均有明显的变化(P0.05)。对血液标本实施溶血处理后,会对血液中的多项生化指标产生影响,尤其降低酶类血液检测真实性和准确性。     

四川S.suis2强毒株溶血素样蛋白HLP序列信息分析及克隆表达产物活性检测

对四川猪链球菌2型(S.suis 2)强毒株05ZYH33溶血素样蛋白(hemolysin-like protein,HLP)编码基因hlp进行序列信息分析、分子克隆表达及溶血活性检测,深入探讨HLP的致病机制.用Blast和Clustal X程序对HLP进行基因同源性分析,用Signal P 4.1和TMHMM Server 2.0分析HLP氨基酸序列.设计合成hlp引物进行PCR扩增,先后将hlp克隆入p MD-18T载体和p ET30a表达载体中,构建p ET30a::hly原核表达质粒.将重组质粒转化至E.coli BL21中诱导表达,并对重组HLP蛋白进行纯化和溶血活性检测.同源性分析表明HLP与多种具有溶血活性的蛋白相似性较高.氨基酸序列分析发现HLP具有信号肽和跨膜区,且由DUF21、CBS和Cor CHly C 3部分组成.序列测定显示hly片段全长1 335 bp,编码445个氨基酸.重组质粒经诱导表达和纯化后电泳显示,HLP分子量约为70 k Da,具有溶血活性.结果表明,HLP是一个膜结合蛋白,不同于能够分泌到细胞外的溶血素Suilysin.重组HLP具有一定的溶血效价,此可能与致病相关.     

不同程度溶血对ELISA两步法检测HBsAg的影响观察

使用ELISA两步法对系列阴性溶血标本、阳性和弱阳性溶血标本及相应正常血浆标本进行HBsAg检测,观察标本不同程度溶血对ELISA两步法检测HBsAg结果的影响。溶血易致弱阳性标本产生假阴性,当Hb≤5g/L时可用于HBsAg的检测,Hb>5g/L应重新留取标本。但为保证检测质量,确保血液安全,应尽量避免使用溶血标本进行HBsAg检测。     

水红花子对小鼠免疫功能及迟发型超敏反应的抑制作用

目的研究水红花子对小鼠的免疫调节作用,并探讨其对迟发型超敏反应的影响.方法:用水红花子水煎剂对小鼠连续灌胃一周,采用MTT法检测脾淋巴细胞转化率、a-醋酸萘酯酶法检测T淋巴细胞数量,利用碳廓清实验检测吞噬细胞活性、定量溶血分光光度法检测IgM抗体生成量,并检测水红花子对DNCB诱导的迟发型超敏反应的影响.结果:与对照组相比,水红花子水煎剂可显著降低小鼠脾淋巴细胞的转化率,T淋巴细胞的数量、巨噬细胞的吞噬指数和IgM抗体生成量,可显著减轻耳部肿胀度,且差异均达到极显著水平.结论:水红花子可以明显抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫功能,并能明显缓解由DNCB诱导的小鼠迟发型超敏反应.     

大豆磷脂的分析与检测

通过利用纸层析来检测大豆磷脂中的基团,运用薄层层析法对大豆磷脂的各个成分进行分析,并用红外光谱技术对磷脂样品进一步分析。结果表明:纸层析分析表明大豆磷脂水解后,内部含有胆碱、乙醇胺、肌醇和丝氨酸这4种基团,薄层层析检测和红外光谱均表明大豆磷脂中有溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺等。     

医用输液、注射器和卤化丁基胶塞的溶血性测定

摘要: 目的通过测定河北省内生产、销售或正在使用的医用输液器、注射器具和注射用卤化丁基胶塞的溶血性,以评价其生物安全性。方法依据国标,采用体外静态直接接触溶血法,以实验兔心脏血为材料,分别测定了一次性输液器、一次性无菌注射器和注射用卤化丁基胶塞各10 批样品的溶血率,并对该3 类产品体外溶血程度进行了比较。结果所测样品的溶血率均＜ 5%。结论所测样品的溶血性均符合相关产品标准的规定,表明该3 类产品在溶血方面具有一定的生物安全性。     

基于多相流的轴流血泵流场分析及溶血指数预测

为研究血泵内部血细胞分布规律及溶血预测方法,以自制轴流血泵为例,应用多相流分析方法,采用多重参考坐标系法(MRF)等技术建立数值分析模型,并通过体外循环实验验证模型的有效性。进一步分析血泵内部血细胞浓度、速度、压力等的分布规律,得到血细胞破坏区域和一般规律。根据优化的溶血模型对血泵的溶血性能进行评估,在此基础上提出溶血实验指标标准溶血指标(NIH)与溶血预测值之间的转换关系。研究结果表明:血细胞在血泵内部不是均匀分布,叶轮处有明显分离现象;血泵内部剪切应力在200 Pa以下的区域的体积分数约为98.6%,高剪切应力主要位于叶轮顶部和外壳的间隙处;在剪切应力为常数时,优化的溶血预测模型和Giersiepen实验得到的溶血模型相符合;采用优化模型计算得到血泵平均溶血预测值0.005 7,具有较好的溶血性能。     

磁珠提取技术在副溶血弧菌检测中的应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,为解决副溶血弧菌检测步骤复杂且周期长的问题,研究开发了一种磁珠提取与PCR联用技术快速检测食品中的副溶血弧菌。首先通过碱性共沉淀法完成Fe₃O₄磁珠的制备,随后在室温条件下通过水解正硅酸乙酯完成Fe₃O₄@SiO₂磁珠制备。探讨了正硅酸乙酯添加量对Fe₃O₄@SiO₂磁珠粒径和磁性的影响。以DNA提取能力为目标,已知浓度DNA为提取对象,分析了Fe₃O₄@SiO₂磁珠粒径和提取体系pH值对Fe₃O₄@SiO₂磁珠与DNA结合能力的影响。结果表明,Fe₃O₄@SiO₂磁珠结合副溶血弧菌DNA的较佳粒径为105.89nm、Fe₃O₄@SiO₂磁珠的SiO₂层为25nm,此条件下Fe₃O₄@SiO₂磁珠表面光滑、分散性良好、饱和磁化强度高,在磁场的作用下10s即可完成副溶血弧菌DNA与杂质的分离,副溶血弧菌DNA的提取率高达80%(提取体系pH值为5.0)。采用优化后的Fe₃O₄@SiO₂磁珠进行DNA提取,结合PCR联用技术,对92份市售水产样品(32份对虾、25份牡蛎、35份贻贝)进行副溶血弧菌筛查。结果表明,Fe₃O₄@SiO₂磁珠提取的DNA均可直接用于PCR检测,被测水产样品中有17份样本的副溶血弧菌检测结果为阳性。此技术与国标检测方法(GB 4789.7—2013)相比,检测时间由一周缩短至4h,提高了副溶血弧菌的检测效率。磁珠提取结合PCR联用技术可检测不同食品中的多种微生物菌种,此研究为食品中的微生物快速检测提供了一种实用新方法。     

应用RNAIII抑制肽（RIP）抑制葡萄球菌毒素产生的实验研究

通过体外实验研究RNAⅢ抑制肽(RIP)抑制葡萄球菌产生肠毒素和溶血素的效果。将200μL浓度为2.5%的二甲基亚砜(DMSO,对照组)和1mg/mL的R IP分别加入到200μL浓度1×108/mL的TECRA菌液,培养3h后,定量检测两组菌液中SEB的含量。将分别含有0.75% DMSO、100μg左氧氟沙星、40μg RIP和40μg RIP+100μg左氧氟沙星的菌液与50μL含有4%家兔红细胞的PBS液共同培养1h后,用酶标仪检测各组上清液中血红蛋白的含量。在ELLISA反应的5、10、30min三个时间点,RIP组菌液中SEB含量均明显低于DMSO组,两组数据具有极显著性差异(p<0.001);RIP组和左氧组菌液中的溶血素的含量明显低于空白组(p<0.05,p<0.01),联合用药组菌液中的溶血素含量明显低于空白组和RIP组,与左氧组相比差别不显著。说明RIP可以有效抑制金葡菌肠毒素和溶血素的产生,与抗生素联用有一定的协同功效。     

大黄鱼弧菌病的荧光抗体快速诊断研究

用0.05%福尔马林灭活大黄鱼的病原菌－－副溶血弧菌制成菌苗,再用该菌苗注射免疫实验兔获得抗血清,进而建立起副溶血弧菌的间接荧光抗体检测技术。应用该技术在福建省连江县厦宫乡大黄鱼养殖渔排进行副溶血弧菌检测。在患病大黄鱼肝脏中均能检测到副溶血弧菌,10尾外观正常的大黄鱼中,有4尾检出副溶血弧菌,而在养殖海水中没有检出副溶血弧菌,以上结果表明,间接荧光抗体检测法不仅可以用于诊断感染发病的大黄鱼,而且也能用于检测带菌尚未发病的大黄鱼。     

新型树脂对内毒素吸附的体外研究

目的探讨新型吸附树脂(EHC-I)对内毒素(ET)吸附性能的研究。方法采用静态吸附实验检测水及血浆内毒素下降率,将内毒素分别加到水及血浆中配制一定浓度的内毒素溶液,树脂与血浆及树脂与水按比例混合,置37℃恒温水浴按一定速度连续震荡2 h,采用动态浊度法在630 nm处测定震荡前、后内毒素水平,然后计算吸附率。同时做溶血实验以检测树脂的生物相容性。结果内毒素水溶液的下降率为94.86%,内毒素血浆溶液的下降率为89.06%,溶血实验显示溶血率为2.86%。结论新型树脂对内毒素有明显吸附效果,溶血率符合要求,为研制适用于临床的高效清除内毒素的血液灌流器提供了依据。     

冷刺激下副溶血弧菌基因转录表达变化分析

目的:应用全基因组DNA芯片技术分析从37℃转入10℃后冷刺激作用下副溶血弧菌基因转录表达变化。方法:10℃低温分别作用于副溶血弧菌20、40和60min后,收集以上3个时间点和正常对照组的菌体,提取RNA,进行一个连续的时相分析。在每一个时间点的细菌基因表达分别与对照组(冷处理前37℃生长状态)相比较,获取每个时间点和正常对照组的基因转录表达上下调的倍数或者其对数值,以荧光信号的变化倍数值为2作为一个临界点,结合SAM分析软件选取基因变化倍数较大的数值。结果:在冷刺激后20、40、60min3个时间点可以检测到大量的转录水平发生明显变化的基因,对于这些发生变化的基因,根据各个时间点的变化规律,进行了分簇归类分析,共分为9簇,每一个簇都存在一种独特的时间依赖的表达模式。在每个相关的时间点,代谢相关的基因以下调为主。面对突然而急剧的温度变化,细胞膜相关的代谢基因发生了明显的重塑。结论:通过对体外低温环境下副溶血弧菌的比较转录谱分析,得到了在低温条件下基因转录发生明显变化的细胞代谢和毒力因子等相关基因,为副溶血弧菌基因转录调控网络的研究提供了一定的理论依据。     

杀鲑气单胞菌溶血素和菌毛蛋白的重组表达及其免疫保护效果研究

为探究杀鲑气单胞菌溶血素和菌毛蛋白能否作为亚单位疫苗候选抗原,本研究针对前期分离的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida, ASM),利用原核表达系统对其进行重组表达,免疫虹鳟后检测其免疫保护效果与诱导的免疫应答特征。Western-blotting结果显示,虹鳟抗灭活ASM血清可与2种重组蛋白发生阳性反应,说明其具有较好的免疫原性。免疫保护实验结果显示,重组溶血素、重组菌毛蛋白及两者混合物免疫对虹鳟的相对免疫保护率(Relative Percentage Survival, RPS)分别为64.6%、37.5%和75.0%;ELISA检测发现,重组溶血素和重组菌毛蛋白单独免疫以及两者混合免疫均能有效诱导虹鳟产生抗各抗原的特异性抗体,在免疫2周后特异性抗体水平均显著高于对照组(P0.05),其中混合免疫组虹鳟血清中抗重组溶血素抗体水平显著高于重组溶血素单独免疫组,但其诱导产生的抗重组菌毛蛋白抗体水平与重组菌毛蛋白单独免疫组无显著性差异;荧光定量PCR检测结果显示,3个免疫组中IL-6、IL-8、TCR及CD4基因的表达水平均显著高于PBS对照组,其中重组溶血素与重组菌毛蛋白共免疫组中IL-6、CD4、MHC-Ⅱ及IgM基因表达水平显著高于其他免疫组。研究结果表明,重组溶血素对虹鳟具有较好的免疫保护效果,且提示重组菌毛蛋白具有开发成为佐剂分子的潜在价值,该结果可为杀鲑气单胞菌亚单位疫苗的研制及应用提供了重要参考。     

1例合并G6PD缺乏的HbH患者急性溶血期血液学参数分析

通过1例合并G6PD缺乏的HbH患者急性溶血期的实验室检查结果,分析其血液学参数在两种疾病同时存在并急性溶血发作时的相互影响以及对诊断治疗的意义。通过对此患者的诊治,得出如下结论:(1)溶血性患者MCV正常或是增大均不能排除地中海贫血的可能,需进行地中海贫血相关检查加以确证;(2)在急性溶血期时G6PD检测值正常的患者不能排除G6PD缺乏症,需待急性溶血纠正1个月后再复查G6PD活性才能得出真实结果。临床诊断及治疗时不可盲信一时的实验室结果,需多方面综合考虑,谨慎处理防止溶血加重。由于此两种疾病均为遗传性疾病,因此预防及治疗此类疾病的最有效方法是:积极婚检、产检以避免有重症缺陷的患儿出生。