烟草拟核小体组装蛋白cDNA的克隆、表达及其蛋白产物的纯化

从烟草BY2细胞cDNA文库中筛选到核小体组装蛋白1(Nucleosome assembly protein1,NAP1)的cDNA，序列分析发现该NAPI的cDNA编码374个氨基酸，与巳知植物来源的NAP1同源蛋白相比具有80%，以上的同源性，而且一些具有重要功能的结构域是相当保守的，如核定位信号，核输出信号，酸性结构域及异戊烯化修饰位点，重要功能结构域的存在预示了NAP1蛋白潜在多种功能，为了深入研究MAP1的功能，应用大肠杆菌表达体系高效表达了烟草NAP1蛋白，并以表达产物进行了分离纯化。     

人超氧化物歧化酶-过氧化氢酶融合基因的构建、表达及其产物的初步纯化和性质研究

尝试应用基因工程技术制备一种兼具人超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的双功能融合蛋白CAT-PTD-SOD,其中的PTD是序列为RKKRRQRRR的短肽.首先通过重叠PCR构筑CAT-PTD-SOD融合基因,然后把该基因转化进入大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)菌株.通过SDS-PAGE、CAT和SOD活性分析以及分离纯化组分的分析确认该重组菌株能够表达CAT-PTD-SOD,其表达量可达总蛋白的8.9%,SDS-PAGE显示其分子量约为85 kD.可溶性实验发现该融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在.抗H2O2能力实验表明CAT-PTD-SOD具有很好的抗H2O2能力,在0.033 mol.L-1、甚至0.067 mol.L-1的H2O2溶液中,其SOD活性20 min内无明显下降.     

人纤溶酶原Kringle5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定

根据人纤溶酶原的cDNA序列,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle5结构域的基因,并将其克隆至表达质粒pET25b( )中。重组载体pET25b（ ）/kringle5转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,在12kD处可见明显的表达条带,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在。包涵体经过体外变复性,SP-SepharoseFF离子交换柱一步纯化,15%SDS-PAGE鉴定考染一条带,纯度达95%以上。所得到的目标蛋白明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生。     

豌豆胰岛素基因克隆、表达及融合蛋白纯化

将人工合成的豌豆胰岛素(PAlb)基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到PA1b基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2x中,然后将重组质粒pMA1-p2X-PA1b转化大肠杆菌DH5a,经IPTG诱导进行可溶性表达．以Amylose Resin亲和层析,纯化出融合蛋白MBP-PA1b．经SDS-PAGE及Western印迹证明,融合蛋白MBP-PA1b在大肠杆菌中表达成功,为深入研究PA1b的功能作了准备．     

化学合成的α-降钙素基因相关肽基因在大肠杆菌中的融合表达及产物分离纯化

化学法合成的α－降钙素基因相关肽基因从pXZ101表达质粒转移到pUC18质粒中测序鉴定后,克隆到pGEX表达载体上,在大肠杆菌C600中表达．融合蛋白经谷胱甘肽亲和层析初步纯化,用凝血酶切去融合蛋白,经SephadexG－50柱纯化后,用溴化氰裂解,再经SephadexG－25柱纯化后得到纯品CGRP．经ELISA反应及放射免疫鉴定具有生物活性;经末端氨基酸测定与设计的一致．动物活体实验证明,大肠杆菌中表达的蛋白有降压活性．     

以自制铜螯合亲和层析柱纯化牛血铜、锌超氧化物歧化酶

本文以自制铜螯合亲和层析柱对牛血铜锌超氧化物歧化酶进行纯化。酶比活提高１１倍，回收率为６１．５％，简便、快速，层析结果重复性好。     

嗜热菌铁硫簇合成途径中SufB、SufC和SufD蛋白的表达、纯化及其功能初步研究

铁硫簇广泛存在于各种生物中,参与电子传递、底物结合和激活、基因表达和调控等重要功能.本文利用嗜热菌Thermus thermophilus HB8研究铁硫簇合成SUF系统中的三个关键蛋白SufB、SufC、SufD.以HB8的基因组为模板,通过PCR技术获得其sufB、sufC、sufD三个基因,随后构建了蛋白表达载体sufB-pET28a（＋）、sufC-pET28a（＋）、sufD-pGEX-6P-1,将其转入大肠杆菌Rosetta（DE3）进行蛋白表达,再利用亲和层析与凝胶过滤层析进行蛋白纯化.随后对SufB、SufC、SufD功能进行了初步研究,证明SufC对ATP具有亲和性,其亲和常数为15.2μmol/L;证明SufB与SufC在体外具有相互作用,并得到了复合体SufBC,为进一步探讨其作用机制奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1009基因的克隆、表达及亲和层析纯化

克隆表达结核分枝杆菌Rv1009基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用聚合酶链反应（PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增了Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入到pGEM—Teasv中,序列测定正确后．再亚克隆到融合表达载体pPro—EX HT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv1009蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009蛋白基因．得到融合6个组氨酸残基的Rv1009蛋白纯度大于80％。证实构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白．为以后的深入研究奠定了基础．     

睾丸组织高表达新基因THE的克隆及表达特征分析

以Homo.sapiens brain为库,选取编号为CA423810的EST序列,联网到NCBI调用Blast服务器分析,该EST序列是一个代表新基因的未知序列.以该序列作为电子探针,通过Internet采用Blast软件进行GenBank的EST数据库检索,获得了该序列的电子延伸产物EST重叠群.经与人类基因组草图进行序列校正,获得了全长为2 232bp的cDNA序列.利用NCBI的ORFfinder服务器,分析发现该序列具有完整的阅读框架,从而确定了基因的全长cDNA序列.该基因定位于染色体上的5q22,编码由388个氨基酸组成,分子量为44859的蛋白质.运用RTP-CR技术,以新基因电子克隆全长cDNA序列设计基因特异性引物,以11例癌组织及相应的正常组织的cDNA、人胎脑cDNA文库和人睾丸cDNA文库为模板扩增目的片段,并以看家基因GAPDH为内对照,检测目的基因的mRNA表达水平.研究结果表明,新基因只在睾丸组织中高表达,在直肠癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌等的癌组织及相应的正常组织中都无明显的表达.因此将该新基因命名为睾丸组织高表达基因(testis high expression,THE).以上结果提示,THE基因可能是在人脑中表达的同一基因的不同剪接本.关键词检索UniGene数据.     

小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达

根据GenBank报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特异性引物对PPRV疫苗株F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:F基因ORF全长1641 bp,编码546个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1~18位氨基酸构成信号肽序列,第488~510氨基酸为跨膜区。构建原核表达载体pETF1和pETF2,转化E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blotting的分析结果表明,F1和F2基因在大肠杆菌中均获得了表达,且均具有良好的反应原性。用Ni-NTA试剂盒纯化F1和F2重组蛋白,为研发检测PPRV特异性抗体的诊断试剂奠定了基础。     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

Ssp dnaB蛋白质内含子介导的精氨酸激酶N末端结构域的表达

采用聚合酶链式反应(PCR)扩增精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)N端基因片段,经双酶切后连接至含有蛋白质内含子Ssp DnaB基因的质粒载体pTWIN1中,将Ssp dnaB和N-domain的融合基因利用双酶切手段重组到含有组氨酸标签(His-tag)的质粒载体pET-28a中,得到含有组氨酸标签的融合蛋白基因,并在大肠杆菌Rosetta中表达,为获得具有天然氨基酸序列的精氨酸激酶N端结构域打下基础。     

AtGT-3b基因克隆及原核表达与纯化

GT-3b转录因子是一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element( GAAAAA)相互作用,促进下游基因的表达,在植物耐盐中起着重要的调节作用.通过分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGT-3b基因,克隆到原核表达载体pCold TF中,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行融合表达;通过纯化得到AtGT-3b融合蛋白,以期用于研究其与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用.     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。     

Molecular cloning, in vitro expression and enzyme activity analysis of violaxan-thin de-epoxidase from Oryza sativa L.

The violaxanthin de-epoxidase gene was cloned from rice (Oryza sativa subsp. japonica). The full length of the cDNA is 1887 bp, encoding a 446-amino acids protein with the transit peptide of 98 amino acids. The bacterial expression vector pET-Rvde was constructed and the expression quantity of the exogenous protein increased with the induction time by 0.4 mmol/L IPTG. Its molecular weight was similar with that of the native VDE. Western blotting indicated that the expressed protein has immunological reaction with the VDE polyclonal antibody. The absorbance spectrum together with xanthophyll pigments quantification by HPLC demonstrated that the expressed VDE has its enzyme activity, which can de-epoxidate violaxanthin into antheraxanthin and zeaxanthin in vitro.