人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

人胎肝MSCs的分离、鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离纯化人胎肝中的间充质样干细胞(mesenchymal-like stem cells,MSCs),观察化学因子诱导其定向分化的作用,并初步鉴定其生物学特性.方法:利用二步离心法、羟乙基淀粉沉淀法及细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎肝MSCs;流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨细胞分化并加以鉴定.结果:从人胎肝中成功分离纯化得到MSCs,P3代细胞有91.2%的细胞处于GO/G1期;表达CD29、CD44、CD105和CD166,不表达造血细胞标志CD15、CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L.在经典诱导条件下,人胎肝MSCs可向脂肪及成骨细胞分化.结论:人胎肝中含有较丰富的MSCs,人胎肝MSCs具有多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程和细胞治疗较为理想的种子细胞.     

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离鉴定人胎骨髓中的间充质样干细胞(m esenchym al-like stem cell,MSCs),探索其体外培养的生物学特性。方法:利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓间充质样干细胞;利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化,并利用特异性细胞化学染色法加以鉴定。结果:从人胎骨髓中成功分离、纯化得到间充质样干细胞,P4代细胞有92.3%的细胞处于G0/G1期;P5代细胞有96.1%的细胞处于G0/G1期;流式细胞仪检测P3代细胞结果显示:人胎骨髓MSC表达CD15、CD29、CD44、CD105、CD106和CD166,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下,人胎骨髓MSCs可迅速向脂肪及成骨方向分化。结论:人胎骨髓中含有丰富的间充质样干细胞,具有较强的多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程的较为理想的种子细胞。     

猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导

脂肪间充质干细胞(AMSCs)是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞．近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景．猪是一种比啮齿类等更接近人类的动物,具有较强的脂肪沉积能力．文中探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件．采用I型胶原酶消化分离脂肪基质微管成分(SVF),传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记．取第5代AMSCs,以含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠的培养基诱导培养,光学显微镜下观察,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变．分化细胞碱性磷酸酶(AIP)染色呈阳性,RT-PCR检测到I型骨胶原(COL-I)和骨钙素(OCN)表达,结果表明可以从SVF中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度．经流式细胞仪检测,其CD105和CD44表达呈阳性,CD14,CD34,S-100,HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向成骨细胞分化．     

长白猪骨髓和脂肪间充质干细胞复制性衰老过程中生物学特性和抗氧化损伤能力的比较

为研究对比长白猪骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adiposederivedmesenchymalstemcells,AMSCs)在体外衰老过程中的生物学特性和抗氧化损伤能力,分别利用贴壁筛选法、Ⅰ型胶原酶消化法分离获得BMSCs和AMSCs,利用流式细胞术鉴定细胞,EdU检测细胞增殖能力,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测基因表达,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)染色检测细胞衰老情况,油红O和茜素红染色检测细胞的成脂和成骨分化能力,TUNEL检测细胞的凋亡情况．分离的BMSCs和AMSCs均高表达CD44和CD90,不表达CD45和CD34．与AMSCs相比,P8代BMSCs增殖能力强,OCT4和Ki67表达高,β-gal阳性细胞数少,成骨分化能力高．但在成脂分化能力方面,AMSCs强于BMSCs．进一步发现H2O2处理P8代细胞时,AMSCs比BMSCs对氧化损伤更敏感,细胞凋亡率显著增加,究其原因可能与抗氧化损伤基因表达的显著降低有关．     

当归诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经元样细胞

研究当归体外定向诱导人脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化的作用.自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.AMSCs用25×10-6L/mL〖JP〗当归注射液预诱导24 h后,用100×10-6L/mL当归注射液不含血清的DMEM/F12进行诱导.光镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.人脂肪组织中能够分离培养出生长旺盛的脂肪间充质干细胞,当归诱导24 h后,部分AMSCs转变为神经元样细胞,出现突起,免疫细胞化学染色NSE呈阳性、GFAP阴性.人脂肪间充质干细胞在体外可被当归诱导分化为神经元样细胞 .     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

目的：探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（ＭＳＣs）向胰岛β样细胞分化。方法：在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化。观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞。结果：未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应：双硫腙染色阳性。结论：人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。     

慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.     

Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞体外成脂、成骨分化的研究

观察体外定向诱导Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞（BMSCs）分化为脂肪细胞和成骨细胞.建立去卵巢骨质疏松山羊动物模型,全骨髓法分离培养其骨髓基质细胞.第二代细胞分别成脂、成骨诱导培养,油红O染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色判定其分化结果.成脂诱导21 d,油红O染色有脂滴形成;成骨诱导14 d,碱性磷酸酶染色阳性;连续诱导35 d,茜素红染色证实有钙化结节形成.Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞在体外可以定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞.