导入反义蜡质基因降低两系不育系稻米直链淀粉含量

为了提高两系不育系261S水稻的选配范围,研究利用根癌农杆菌介导法将蜡质基因反义片段导入261S未成熟种子形成的愈伤组织,经抗性筛选及PCR检测获得46棵T0代转基因植株．采用GUS染色追踪分析获得转反义蜡质基因纯合的T2代转基因植株．10个转基因植株糙米经直链淀粉含量分析显示：未转基因261S对照水稻糙米直链淀粉平均含量为18．54％,大部分转基因后代糙米直链淀粉含量有不同程度的降低,降低程度最大的转基因后代糙米直链淀粉平均含量为13．55％,比对照降低26．91％．开展本研究可为两系杂交稻优质育种奠定基础．     

反义RNA对质粒复制的调控作用

反义RNA的存在最先是在质粒和其它原核附属DNA元件中被证实的.对这些体系深入的研究揭示了原核反义RNA结构和功能的联系,以及正义/反义RNA相互作用的机理.本文着重叙述反义RNA在质粒复制中的作用及其进展.     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

大麦黄矮病毒抗性基因的Ti质粒构建

通过酶切、连接、转化等技术,将大麦黄矮病毒抗性基因制酶基因ＯＲＦ２插入Ｔｉ质粒ｐＧＡ４８２的Ｔ－ＤＮＡ区,从而提供了新的目的基因转化小麦的农杆菌／质粒系统。     

大麦黄矮病毒抗性基因的Ti质粒构建

通过酶切、连接、转化等技术 ,将大麦黄矮病毒抗性基因复制酶基因ORF2插入Ti质粒pGA4 82的T DNA区 ,从而提供了新的目的基因转化小麦的农杆菌 /质粒系统 .     

双基因重组质粒及其应用

近年来，随着生物工程技术的发展，人们已成功地将两种不同目的蛋白的基因构建于同一表达载体。这种双基因载体的构建克服了单一目的基因表达载体的不足．已在农业、医药和生物工程基础理论研究中得到广泛应用。     

hTR基因反义表达质粒构建及序列分析

从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增得到的 h TR基因的 DNA序列与所发表的序列完全一致 .构建的反义表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 p LNCX的克隆位点上 ,构成了 h TR基因的反义表达质粒     

带有XylE基因的EB病毒穿梭质粒pFD891的构建

构建了一个以EB病毒为基础、以邻苯二酚氧化酶(XylE)基因为靶基因、以潮霉素B邻酸转移酶为转化细胞的选择标记基因的穿梭质粒。这种质粒既能在细菌中复制,又能在真核细胞中自主复制,并有较高的拷贝数,因而能很容易地从真核细胞中分离出来,并可用来研究基因突变和突变类型的形成机制,建立一种化学物质诱变性的分子检测系统。     

含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因真核表达重组质粒的构建

用ClaI／EcoRI双切酶切带有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)极鞭毛蛋白FlaI基因的质粒p MD18-FlaI，回收目的基因片段，插和到真核细胞表达载体pIRESneo同样经ClaI/EcoRI切开的窗口中，成功地将FlaI克隆到pIRESneo中，获得有意义的重组质粒pIREneo－FlaI,构建的pIREneo－FlaI真核表达重组质粒，将为海水经济鱼类的副溶血弧菌DNA疫苗的研制奠定基础。     

蝴蝶兰ACC氧化酶cDNA片段的克隆及其反义植物表达载体的构建

根据已报道的蝴蝶兰ACC氧化酶的基因序列,设计了一对引物,通过RT—PCR从蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC氧化酶的cDNA片段,将其连接到pMD19-T载体上进行测序．结果显示,该片段与参考的已报道序列具有99．70％的同源性．测序后将该基因的cDNA序列反向插入pBI221的CaMV35S启动子和nos terminator之间,构建了蝴蝶兰ACC氧化酶的反义基因植物表达载体,为进一步转化蝴蝶兰研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础．     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种,但其可利用的碳源范围窄.对其进行分子生物学基础研究和基因工程改造的工作早在上世纪八、九十年代就开始了,但基于其独特的生物学特性,至今遗传操作手段仍不成熟.以大肠杆菌(E.coli)pBR328为出发质粒,分段插入带Z.mobilis乳酸脱氢酶基因ldh、分别作为左右同源臂、1.5 kb大小的DNA片段,构建了Z.mo-bilis定点整合型质粒pBR328-ldhR-ldhL(6 239 bp),此质粒两同源臂片段即ldhR和ldhL的中间有稀有酶切位点NotI和SfiI,以方便插入待整合片段.经Notl位点插入1 216 bp氯霉素抗性基因cml,将相应质粒pBR328-ldhR-cml-ldhL以环型和线型形式分别电击转化Z.mobilis ZM4菌株,都成功筛选到了ZM4 ldh::cml菌株,证明此定点整合质粒是方便可用的,为对Z.mobilis的定点遗传操作提供了很好的基础.     

bcl-2基因反义核酸对HL-60和K562白血病细胞生存的影响

目的：探索ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞生存的影响。方法：主要应用细胞培养和细胞克隆的方法,检测了ｂｃｌ－２基因反义核酸对ＨＬ－６０和Ｋ５６２白血病细胞系生存的影响。结果：ｂｃｌ－２基因反义核酸浓度在２～８μｍｏｌ／Ｌ和６～１２μｍｏｌ／Ｌ分别对ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞的生存有明显的抑制效应,呈剂量－效应关系,二者起效应时间均为第３ｄ;ｂｃｌ－２基因反义核酸浓度为４μｍｏｌ／Ｌ时,对ＨＬ－６０和Ｋ５６２细胞集落形成都有明显抑制效应。结论：ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞生存有明显的影响。     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

反义RNA技术及其在农业领域的应用

介绍了反义RNA的概念及作用机理,对反义RNA技术及其在农业领域的应用进行了概述．反义RNA技术是借助基因重组技术,根据碱基互补原理,用人工合成或生物体合成的特定RNA片段（或其化学修饰物）抑制或封闭基因表达的技术。在农业领域反义RNA技术主要应用于果实性状及品质的调控,对观赏植物性状的调控,植物抗病,控制油料种子中脂肪酸的合成,控制雄性不育,降低或去除食物中有害化学成分等方面其功能获得可靠的成效．