抗昆虫蝎毒素多肽的重组表达研究

蝎毒素是蝎子自我防御和捕食的有力工具,属于活性短肽。抗昆虫蝎毒素多肽作用于昆虫细胞膜离子通道,调控通道动力学特性,是潜在的生物杀虫剂,具很高的研究价值。序列比对分析发现,抗昆虫蝎毒素多肽有高保守性,序列同源性达67%,其中有4个保守的半胱氨酸残基,这可能与其抗昆虫作用的结构有关。但天然蝎毒素蛋白获取较困难,致使抗昆虫毒素多肽的结构与功能研究受限,因此,利用基因重组技术获得高纯度高活性重组蝎毒素是有效途径之一。本文综述了抗昆虫蝎毒素多肽外源重组表达的研究现状,旨在更深入全面理解其结构及抗昆虫机理等,以助推后续相关研究。     

蝎毒素多肽与钠通道特异性结合位点研究进展

蝎毒素多肽是一种通道门控调节剂,早先研究发现其通过与离子通道的电压感受域结合影响通道的门控特性。新近研究表明,门控调解剂毒素与离子通道孔区也具有额外结合位点。因此,本文就蝎毒素多肽与钠通道特异性结合位点相关研究展开综述,以梳理门控调节剂毒素的结构与调节功能,为蝎毒素多肽与钠通道结合位点结构与功能的解析提供依据,也为靶向钠通道药物的设计与开发提供参考。     

蝎α—毒素的分子进化：加速突变与功能趋异

蝎α－毒素为一类空间结构高度相似而药理学功能趋异的蛋白质家族。cDNA序列分析表明蝎α－毒素5′非翻译区和信号肽编码区序列的保守性显著高于成熟毒素编码区，3′非翻译区在药理学组内高度保守。而且，成熟毒素编码区密码子第1，2和3位核苷酸突变率相似。非翻译区内每个位点的核苷酸替代数（K）小于成熟毒素编码区内每个同义位点的核苷酸替代数（Ks)，而且成熟毒素编码区内每个非同义位的核苷酸替代数（Ka)接近或大于Ks值。上述数据表明，蝎α－毒素成熟肽编码区内的突变为加速进化方式。这一结论进化树结果的支持。此外，研究还表明稳定3D结构的15个保守性残基靠近分子内部，这可能作为蝎α－毒素结构性限制因素在进化过程中维持CSαβ结构的恒定；4个热点突变区分布于分子表面的潜在功能区，表明正性Darwin选择驱动了蝎α－毒素的加速进化。研究结果合理地解释了蝎α－毒素保守性3D结构与趋异的药理学功能之间的关系。     

蝎α-毒素的分子进化:加速突变与功能趋异

蝎α-毒素为一类空间结构高度相似而药理学功能趋异的蛋白质家族.cDNA序列分析表明蝎α-毒素5′非翻译区和信号肽编码区序列的保守性显著高于成熟毒素编码区,3′非翻译区在药理学组内高度保守.而且,成熟毒素编码区密码子第1,2和3位核苷酸突变率相似.非翻译区内每个位点的核苷酸替代数(K)小于成熟毒素编码区内每个同义位点的核苷酸替代数(Ks),而且成熟毒素编码区内每个非同义位点的核苷酸替代数(Ka)接近或大于Ks值.上述数据表明,蝎α-毒素成熟肽编码区内的突变为加速进化方式.这一结论得到进化树结果的支持.此外,研究还表明稳定3D结构的15个保守性残基靠近分子内部,这可能作为蝎α-毒素结构性限制因素在进化过程中维持CSαβ结构的恒定;4个热点突变区分布于分子表面的潜在功能区,表明正性Darwin选择驱动了蝎α-毒素的加速进化.研究结果合理地解释了蝎α-毒素保守性3D结构与趋异的药理学功能之间的关系.     

海葵多肽类神经毒素的结构与药理学功能

海葵以其触手刺细胞中的毒液行使捕食和防御功能,其毒液中富含各种多肽类神经毒素,分子量为3￣7kDa之间,分子序列中含多对二硫键以稳定其结构。海葵神经毒素以钠离子通道毒素和钾离子通道毒素为其主要成分,此外还发现有作用于其他离子通道的成分,此外,还有部分海葵毒素目前尚不清楚其分子靶标。不同类型的海葵毒素具有不同的空间结构。海葵毒素多肽的分子多样性使其成为动物毒素研究的一个重要分支,同时海葵多肽毒素对不同离子通道的特异性和高亲和性,使得它们成为神经生理学和药理学研究的一种重要工具。     

短链蝎毒素BmK38的1H-NMR谱峰归属、二级结构分析及溶液构象

BmK38是最近从东亚钳蝎（Buthus martensi Karsch，BmK）中分离纯化得到的一种短链蝎毒素．应用2D-NMR技术研究BmK38的溶液构象，通过分析其在水溶液中的DQF-COSY、TOCSY和NOESY等1^H—NMR谱，识别了BmK38全部40个氨基酸残基的自旋体系，并通过分析NOESY谱图中dαN、dNN、dβN的联系，完成了序列专一性谱峰归属，标定了全部主链质子和绝大部分侧链质子的化学位移．根据谱峰归属的结果和NMR数据分析了BmK38的二级结构组成并且计算出BmK38的溶液构象．结构计算的结果与前述二级结构的分析是一致的．结果表明，肽段Gln8-Arg17形成α螺旋，而肽段Gly22-Glu29以及Leu32-CYS39构成反平行的口折叠，属于典型的短链蝎毒素的折叠形式．通过与其他OUKTx短链蝎毒素的结构比较，讨论了BmK38的结构特异性以及结构功能的相互关系．     

东亚钳蝎抗神经兴奋肽在大肠杆菌中的表达

自从 1 96 4年以来Ｍｉｒａｎｄａ等人[1] 报道Ａｎｄｒｏｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ和Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕ中的神经毒素 ,蝎毒中一些神经毒素尤其是哺乳动物毒素和昆虫毒素已被广泛研究 .从新鲜蝎毒中制备和纯化天然神经毒素困难重重 ,1 988年Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ等人[2 ] 首次由Ｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ蝎中昆虫神经毒素氨基酸序列推导并化学合成其基因序列 ,且在杆状病毒载体中得到表达 ,自此人们广泛试验将各种属的系列蝎毒素基因重组到大肠杆菌、酵母、杆状病毒、植物等表达载体进行表达 .在中国 ,蝎子及其组织或抽提物被…     

蝎毒素成分、应用价值及其研究进展

对蝎子的分类、蝎毒素的组成成分及其性质、蝎毒素应用价值、蝎毒素研究进展及蝎毒素研究方向四个方面进行了阐述，说明蝎毒素是一种进行分子生物学研究的良好材料。     

少棘蜈蚣钠通道毒素NTX-Ssm97的表达、纯化和鉴定

以同源序列比对法从湖北少棘蜈蚣毒腺转录组数据库中筛选到了一个新的毒素多肽基因NTX-Ssm97,其序列与Nav1.7抑制性多肽μ-SLPTX-Ssm6a高度同源.采用基因工程技术,构建了pGEX-4T-1-NTX-Ssm97原核表达载体,并利用E.coli Rosetta对毒素成熟肽的原核诱导表达和分离纯化.MALDI-TOF-MS质谱鉴定结果显示:纯化的NTX-Ssm97分子量与理论值基本吻合,表明少棘蜈蚣转录组数据库有助于筛选靶向Nav1.7钠通道的抑制性毒素多肽基因.     

梅花鹿骨形态发生蛋白BMP4基因的克隆与序列分析

通过提取梅花鹿肝脏总RNA以及采用RT-PCR技术,成功克隆梅花鹿骨形态发生蛋白BMP4基因序列,并对其核酸序列、蛋白质序列,功能保守区、亲疏水性进行生物信息学分析,同时构建序列进化树以及部分结构的三维模型.该序列已提交Genbank(索取号:HQ877675).该研究可为日后通过基因工程手段表达重组梅花鹿BMP蛋白并探究其药理作用提供基础.     

蛇三指环毒素家族的研究进展

蛇毒是其毒腺分泌的,主要由有生物活性的蛋白和多肽等混合物组成.这些蛋白和多肽大部分可归为两大类:酶类和非酶类.三指环毒素家族是其中最大的非酶类毒液蛋白类群,虽然该家族的蛋白质都是由β-折叠片组成的三指环结构,但是却呈现出了多样的功能活性.神经毒素是该家族中很重要的组分.三指环毒素家族中不同的功能群体结构的差异,导致了其生物功能的多样性以及每个功能类群的特殊性.蛇的三指环毒素家族很可能起源于无毒的三指环祖先蛋白.研究表明,正选择在该毒素家族的进化和多样性形成中起重要作用.     

芋螺毒素lt1c的重组表达及镇痛功能

lt1c是从信号芋螺毒管中发现的一种A超家族毒素多肽,为深入研究其功能,采用pTRX表达系统将lt1c与硫氧还蛋白基因进行融合,转入大肠杆菌进行表达后,通过超声破碎、亲和层析、酶切和凝胶过滤层析等方法,最终得到目的蛋白。组织水平的青蛙坐骨神经-腓肠肌活性研究表明,重组表达的lt1c在6μmol/L浓度下,30 min内完全抑制肌肉的收缩,且其作用可逆。进一步的功能研究发现,lt1c能够抑制热板疼痛模型小鼠的舔足反应,提示A超家族芋螺毒素lt1c可能具有一定的镇痛活性。该研究为筛选新的多肽镇痛药物奠定了基础。     

含RGD序列水蛭素嵌合抗栓剂的构建与表达

通过对水蛭素及一些含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽类血小板聚集抑制剂结构与功能的分析,设计并构建了两个在水蛭素C端融合RGD序列的嵌合分子。嵌合体基因分别重组到表达载体pET-21a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制酶消化和DNA序列分析,证明两种重组质粒与设计完全一致。由于RGD-水蛭素嵌合基因上游连接了金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的信号肽序列,在IPTG诱导下两种嵌合分子都获得了分泌表达,表达产物主要集中在细胞周质空间。通过离子交换层析和凝胶过滤层分别对两种嵌合体蛋白进行纯化,纯化产物在Tricine-SDS-PAGE中都显示为单一条带。活性分析结果表明两种嵌合体蛋白在保留水蛭素抗凝血酶活力的同时,还呈现抗血小板聚集活性。     

虎纹捕鸟蛛毒素-ILys13突变对生物学活性的影响

从虎纹捕鸟蛛Selenocosmia (Ornithoctonus ) huwena的粗毒中分离纯化出来的虎纹捕鸟蛛毒素-I(HWTX-I)是一种多肽类神经毒素.为了进一步探明其结构与功能的关系,采用以固相多肽合成为核心技术的蛋白质工程方法直接构建了Ala取代Lys13的单残基突变体K13A-HWTX-I,并同时合成了HWTX-I的全序列sHWTX-I作实验对照.合成产物经质谱和序列分析鉴定无误后在含谷胱甘肽的缓冲体系中氧化折叠并用离子交换和RP-HPLC纯化.活性测定结果表明,氧化复性后,sHWTX-I与天然HWTX-I的生物学活性完全相同,而K13A-HWTX-I的生物学活性下降了87%,提示Lys13是与HWTX-I的生物学活性密切相关的重要残基.     

蜘蛛多肽类毒素异源表达的研究进展

蜘蛛毒液是一个巨大的天然多肽和蛋白质分子组合库,具有多种生物学功能．但仅靠从天然的蜘蛛中提取出研究所需的蜘蛛多肽类毒素远不能满足对其的全面研究和开发利用．相比化学的固相合成法合成的低产量和较高成本,利用基因工程的方法异源表达蜘蛛毒素有较大的优势．综述了近年来利用大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和植物表达系统异源表达蜘蛛毒素的研究进展．     

东亚正钳蝎毒素基因BmKbpp的原核表达及其抗菌功能初步鉴定

一级结构分析和二级结构预测表明无二硫键蝎毒液多肽(NDBPs)BmKBPP具两亲性α-Helix结构,含有大量带净正电荷的碱性残基(Arg和Lys),符合多价阳离子抗菌肽的典型特征。采用PCR法和质粒载体pGEX-5X-1构建BmKbpp、EGFP及BmKbpp/EGFP与GST的原核融合表达载体,3个表达载体与pGEX-5X-1分别在Rossetta(DE3)菌中进行表达,并测定4个Rossetta(DE3)表达工程菌诱导表达的生长曲线。结果表明,BmKBPP是一个具有很强抑菌功能的抗菌肽,GST、BmKBPP及EGFP3个蛋白一起融合表达可获得少量蛋白的表达,这将为后续的功能研究和应用研究奠定基础。     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

TRPV1通道的药物靶点及多肽类毒素调制剂

辣椒素受体TRPV1为瞬时感受器电位通道家族中的成员。作为一种多觉感受器,响应和整合生物体视觉、听觉、温觉、痛觉和触觉等多种感觉相关的渗透压、p H值、机械、离子强度的刺激变化。已发现TRPV1具多个电压和药理活性位点,受H+、ATP、钙调蛋白和多肽等内、外源分子的门控调控。本文聚焦TRPV1及多肽毒素类调制剂的药物靶点选择性,意图推进该通道结构与功能的解析,为靶向TRP通道药物的设计与发现提供科学依据。     

虎纹捕鸟蛛神经毒素Huwentoxin-Ⅰ的二级结构研究

Huwentoxin-Ⅰ是一种小分子量的多肽类毒素,它能阻断脊椎动物的神经肌肉接头传递。该毒素分子内含33个氨基酸残基,有三对二硫键。本文报道用圆二色性光谱分析法对该毒素二级结构的测定和分析,并用Creenfield等介绍的方法计算其二级结构中各种成分的含量。结果表明,此多肽分子中,α螺旋约占22—28％,β折叠约占22—35％,而β转角和无规卷曲约占41—49％。实验还表明,此毒素在不同pH条件下的二级结构均比较稳定,将它加热到80℃保温20分钟后再测定其CD光谱,其二级结构成分变化不大。用各种不同的方法对其二级结构进行了预测,结果表明该分子一级结构序列N-末端有一小段β折叠,C-末端有一段α螺旋,分子中部的大部分残基为β转角和无规卷曲构象。     

A型肉毒杆菌毒素的基因测序与分析

对国内A型肉毒杆菌毒素基因测序,分析了解毒素基因结构并推测其氨基酸序列。提取肉毒杆菌总DNA,利用自行设计的引物对目的基因进行PCR扩增,把目的基因导入E.Coli JM109,筛选含目的基因的阳性克隆菌进行测序和分析,从而了解毒素基因结构并推测其氮基酸序列。对A型肉毒杆菌毒素基因的核苷酸序列成功测序并与GenBank中的相应序列比较,其序列同源性为96％。推测其氨基酸序列同源性为100％。成功地对A型肉毒杆菌毒素的基因进行了测序,这为肉毒杆菌毒素中毒的快速诊断,以及进一步探求以基因工程方法生产此毒素奠定基础。