苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节niffix基因的表达,同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因,通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii NH01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA,研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响,研究结果发现,引入KpnifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力,同时初步试验结果证实,带额外nifA的大根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性,推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段,由于结瘤因子是诱导主形成根瘤的主要信号分子,而结瘤过程具有自我调节作用,植株一旦结瘤,就会抑进一步结瘤,因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率。     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

nifA突变的苜蓿根瘤菌在根瘤中的转录组学分析

用全基因组微阵列比较了根瘤中苜蓿根瘤菌1021的nifA突变菌和野生菌的基因表达谱. 分析结果表明, nifA的缺失引起601个基因的表达发生变化. 这些基因分别属于生物大分子的合成代谢、三羧酸循环及呼吸代谢以及结瘤固氮过程等多个功能组, 预示着根瘤中细菌的生长状态发生了显著的变化. 在根瘤中, fixK以及受其激活的基因在nifA突变菌中的表达量显著高于野生菌. 定量实时PCR分析表明, 根瘤中fixLJ的转录水平在nifA突变菌中显著高于野生菌. 通过统计学方法从13个表达发生显著变化的基因的上游调控序列中找到推测的NifA结合位点.     

异源nifA基因对苜蓿中华根瘤菌nifA突变体的互补分析

为深入研究苜蓿中华根瘤菌NifA的特性, 分别用组成型表达的慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的nifA 基因互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体, 观察其共生表型. 结果表明, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌nifA 基因不能互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体的共生表型. 以苜蓿中华根瘤菌 nifA 突变体为遗传背景, 利用全基因组微阵列实验比较分析引入异源nifA 基因后产生的基因表达谱的变化. 结果显示, 苜蓿中华根瘤菌自身NifA蛋白引起238个基因的表达发生变化. 这些表达差异的基因分属共生、能量和中心代谢、持家、细胞结构与运输等生物学功能组. 慢生型大豆根瘤菌、紫云英根瘤菌和阴沟肠杆菌的NifA蛋白分别引起了20, 7和9个基因的表达发生变化. 这些基因主要是固氮相关基因, 但差异不及苜蓿中华根瘤菌NifA互补菌明显. 以苜蓿中华根瘤菌nifH启动子与lacZ融合基因为报道基因, 研究nifH的表达. 结果指出, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的NifA蛋白只能部分激活苜蓿中华根瘤菌nifH的表达, 激活水平分别为苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白激活率的70%和50%, 与微阵列实验结果相符.     

固氮酶活性中心网兜模型研究的回顾和前瞻

研究自然界中固氮酶是如何把氮分子转化为氨的课题已经成为当前分子生物学的热点之一.1992年,Kim和Rees发表了棕色固氮菌(Av)的固氮酶的分辨率为0.27nm的晶体学分析结果,他们最近又进一步与Chan合作发表了分辨率为0.22nm的固氮酶晶体学分析结果,阐明了FeMo辅基和P-簇对活性中心模型结构.Bolin等也发表了对巴氏梭菌(Cp)的固氮酶的分辨率为0.22nm的晶体学分析结果.这些重要结果,标志着固氮酶研究已经上了     

接近固氮酶的钼-胰岛素模型

象棕色固氮菌(Azotobacter vine-landii)这类细菌的固氮酶,如何固定大气中的氮为氨,是令人感兴趣的问题.美国加州大学舒劳策(N.Schrauzer)博士的研究指出钼是唯一的催化部位. 固氮酶含钼、铁和硫.包括这三种元素的原子簇曾被认为是氮还     

人工光照条件下深红红螺菌的氢代谢途径

深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在不同培养条件下分别有多种酶参与氢的代谢. 为研究R. rubrum在人工光照条件下氢代谢途径及各代谢途径对光合产氢的贡献, 分别构建了3个缺失突变株: Fe-固氮酶缺失单突变株、Fe-固氮酶和Mo-固氮酶双缺失突变株以及吸氢酶和Fe-固氮酶双缺失突变株. 比较R. rubrum野生型菌株、吸氢酶缺失单突变株及所构建3个突变株的固氮酶活性及光合氢产量. 结果表明, 在人工光照条件下, Mo-固氮酶和Fe-固氮酶是R. rubrum产氢的关键酶; 除Fe-和Mo-固氮酶外还有第3种途径参与氢代谢, 该代谢途径产生的氢气量较小. Mo-固氮酶、Fe-固氮酶和第3种途径对光合产氢的贡献率分别为93.5%, 4.9%和1.5%; 吸氢酶消耗13.3%的氢气. 甲酸裂解氢酶活性测定表明, 第3种产氢途径并非由甲酸裂解氢酶介导, 而可能是一种未知酶参与人工光照条件下R. rubrum的氢代谢.     

细菌产酶的基因调节——操纵子模型学说的提出及迄今十多年来的发展

细菌在工农业生产中起着重要的作用。它产生多种酶,而这些酶的产生受环境条件的影响。人们根据其中一些影响的不同,把酶分为三类,即:诱导酶——乳糖酶、L-阿拉伯糖酶等,它们仅在底物存在下,才能产生;阻遏酶——氨基酸、核苷酸等的生物合成系统的酶,它们的产生受这些合成终末产物的阻遏;构成酶——淀粉酶、蛋白酶等,它们的产生既不受底物的诱导,也不受催化产物的阻遏。产酶中,诱导或阻遏现象的存在,对细胞经济(cell economy)来     

产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423~(Ile)位点的突变导致固氮酶催化活性降低

基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论,探索从与P原子簇共价相连的β-93Cys出发至FeMoco之间重要的氨基酸位点.通过分析固氮酶钼铁蛋白的结构,利用体外定点突变和基因替代技术,将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)固氮酶β-102Asn,α-431Lys和α-423Ile位点分别替换为β-102Ala,α-431His和α-423Pro,获得Nβ102A,Kα431H和Iα423P突变株.3个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响,其中Iα423P突变株几乎无固氮生长,细胞乙炔还原活性显著下降;在42 L发酵罐中培养,其细胞最高固氮酶活性仅为野生型菌株的1/6;qRT-PCR检测发现此突变株nifD基因4倍的上调表达.分离纯化Iα423P钼铁蛋白,其最高C2H2和H+还原水平分别为野生型的13%和21%.根据以上研究结果推论,突变固氮酶的催化活性显著降低,或与直接打破α-423Ile与高柠檬酸长臂之间的氢键有关,推测α-423Ile是固氮酶催化底物还原过程中,电子经高柠檬酸长臂进入活性中心Mo位的入口氨基酸.     

控制细菌固氮作用的遗传因子

目前微生物中酶复合体的结构已为人们所熟悉,此种复合体能从空气中固定分子氮。但是为了控制这一过程,必须扩大我们对于能把这种复合体进行编码的遗传因子结构的了解。近年来已成功地分析出一些能确定从微生物中固氮能力的遗传因子Klebsiella Pneumoniap,并将它们引入有较好研究的细菌——大肠杆菌(Escherichia coli)的细胞内。这种方法可以查明能确定固氮能力的17种遗传因子的存在。它们以某种分组的形式排列,组成7或8个操纵子,这就保证有可能同时合成这些遗传因子——固氮酶的某些产物。例如,控制固氮酶合     

柠檬酸氧钒(V)配合物Na_2(NH_4)_4-[VO_2(cit)_2]·6H_2O的合成和晶体结构

最近,Rees等相继发表了Mo-Fe蛋白0.22和0.27nm分辨率的晶体结构分析结果,揭示了固氮酶金属活性中心FeMo-辅基的结构图象,其中Mo原子处在一端的角落位置上,并且同高柠檬酸的羟基和羧基形成双齿配位.考虑到自然界中钒可取代钼成钒固氮酶,为了了解高柠檬酸在金属酶活性中心中的作用,本文报道含羟基和羧基双齿配位的二聚柠檬酸氧钒(V)配合物Na_2(NH_4)_4[VO_2(cit)]_2·6H_2O(H_4cit=柠檬酸)的合成、光谱和结构.     

棕色固氮菌产生的钼配位化合物

在固氮酶的酶促反应中,过渡金属钼在活性部位起着重要作用.但是,钼在固氮酶中的功能及其配位化学迄今尚未彻底阐明.为探索其作用,曾用模型化合物和从固氮酶中提取低分子量的钼肽或钼辅因子来进行研究.本工作是用棕色固氮菌所产生的钼配位化合物     

肝氨甲酰磷酸合成酶I基因转录起始位点的测定

氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是尿素循环的第一个酶,主要存在于肝细胞线粒体中,是肝组织特异酶,与肝细胞的分化有关.我们曾观察到在大鼠肝癌诱发过程中,CPSI酶活性降低,实验证明癌变过程中CPSI基因表达的异常与基因转录调控可能有关.真核基因的转录的调控是通过反式作用因子(trsns-acting factor)与顺式作用元件(cis-acting element)的相互作用而实现的.顺式作用元件多存在于转录起始位点的5′端上游,对基因转录有调控作     

固氮酶Fe中心模型化合物的合成、结构和催化活性的研究

1981年,忻新泉等人,从配位化学的角度出发,提出了固氮酶双中心作用机制。认为在固氮酶中Fe原子是吸附活化底物的中心,它与由Mo—Fe—S簇化合构成的还原中心协同作用完成底物的还原过程。为了论证Fe是吸附活化中心,我们合成了含有铁硫的原子簇化合物,作为模拟体系,并进行了催化活性的研究。本文报道新型[(C_2H_5)_4N]_4[Fe_6S_9(SCH_2CH_2OH)Cl]簇合物的合成、结构和催化活性的研究。     

氯离子和溶氧对苯丙氨酸解氨酶的失活作用

由肉桂酸和氨酶法合成L-苯丙氨酸(L-Phe)的反应是热力学上不利的.因为当苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)被用在具有高pH,高氨和相对高的肉桂酸浓度的环境中被认为引起PAL的快速失活.通过转化反应实验,证明氯离子和溶氧的存在是PAL真正失活的因素.     

用有机铜试剂的1,4-加成反应合成15(R,S)-15-甲基前列腺素E_2甲酯及其11-甲醚衍生物

在前列腺素E_2(或甲酯)引入15-甲基后,可以阻止前列腺素15-羟基脱氢酶的代谢作用,从而大大地提高其生物活性,且作用时间延长.但目前合成这类15-甲基前列腺素全系经15-甲基PGF转化而来.在前文中我们报告了用有机铜试剂的1,4-加成反应合成11-去     

封端率对PTMG型聚氨酯胶黏剂性能的影响

文章研究了用PTMG(聚四氢呋喃)、TD(甲苯二异氰酸酯),并用氨丙基三甲氧基硅烷(A-1110)封端合成PU(聚氯酯)胶黏荆.在合成过程中采用其他相关条件不变,仅改变封端率来制的系列胶膜,测试了胶膜的吸水率、力学性能、耐热性能.同时还运用透射电镜、红外光谱对所合成的材料进行了表征,实验结果表明:可知PU胶黏荆中已成功地引入了硅链节,较佳的封端率为5%～10%.     

{[Et_4N]_3[Mo_2FeS_6(SCH_2CH_2S)_2}_4·CH_3CN簇合物的合成、结构和性质研究

利用EXAFS光谱分析、钼铁蛋白、钼铁辅因子与钼铁硫多核模拟物比较,其钼的周围具有相似的笼型结构,从而推测固氮酶的活性中心,很可能是一类钼铁硫原子簇化合物。因此模拟固氮酶的活性中心——钼铁硫簇合物的合成、结构和性质研究将引起人们极大兴趣。本文报道{[Et_4N]_3[Mo_2FeS_6(SCH_2CH_2S)_3]}_4·CH_3CN簇合物的合成、结构和性质研究。     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体 a 基因的调控

为研究白细胞介素2受体a亚基(IL-2Ra)基因中与负调控元件NRE (-391/-381 bp)呈反向重复的序列NIRS (-153/-143 bp)中, 在该基因表达中的作用, 通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性发现, NIRS与NRE不仅共同阻遏IL-2Ra基因的组成性表达, 还共同参与介导PHA对该基因启动子的诱导活性. EMSA检测显示, 激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白; HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白; 但是, 激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象, 其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带. 紫外交联实验检测发现, 在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83. 结果显示, 不同细胞中, 反式作用因子能通过NRE和/或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL-2Ra 基因启动子活性起关键调控作用.