草鱼(Ctenopharyngodon idella)组织蛋白酶L基因克隆及表达特性分析

为探究组织蛋白酶L(Cathepsin L,CtsL)是否在草鱼(Ctenopharyngodon idella)体内发挥免疫功能,根据已构建的草鱼肌肉转录组数据库中unigene序列,采用RACE技术首次克隆得到全长为1 496 bp的草鱼组织蛋白酶L基因(CiCtsL)cDNA序列。序列分析和同源建模显示该基因编码的蛋白具备组织蛋白酶前体抑制结构域I29和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1结构域。系统进化分析表明,CiCtsL与斑马鱼CtsL聚为一支。CiCtsL mRNA在7个组织中均有表达,其中肝脏中的相对表达水平最高。感染GCRV后,CiCtsL在各组织中的表达量显著上调,呈现先上升后下降的趋势。研究表明CiCtsL参与了草鱼抵抗GCRV的免疫应答反应,可在草鱼先天免疫调控中发挥重要作用。     

草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F_1与其亲本的肌肉特性比较研究

为探讨草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F_1的肉质特点,以同规格的草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F_1和其亲本草鱼(母本)、赤眼鳟(父本)为材料,采用质构仪测定分析比较了三者肌肉质构特性,采用冷冻切片法和HE染色法统计分析比较了三者肌纤维数量和密度,采用实时荧光定量PCR的方法分析了与肉质特性关联紧密的钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、Ⅰ型胶原蛋白α1基因(COL1A1)和α2基因(COL1A2).在杂交F_1和亲本肌肉中的表达量.结果显示:杂交F_1与母本草鱼、父本赤眼鳟的肌肉黏附性、胶着性和回复性无显著性差异(P0.05);杂交F_1的肌肉硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均显著高于母本草鱼(P0.05),与父本赤眼鳟无显著差异;杂交F_1的肌纤维直径和密度与其母本草鱼无显著差异(P0.05),与其父本赤眼鳟差异显著(P0.05);COL1A1和COL1A2两个基因在杂交F_1肌肉组织中的表达量显著高于其母本草鱼(P0.05),而与其父本赤眼鳟无显著差异(P0.05);CAST基因在杂交F_1肌肉组织中的表达量显著高于其母本草鱼(P0.05),与其父本赤眼鳟无显著差异(P0.05).     

高脂对中华鳖肝脏组织中microRNA及相关基因表达的影响

为研究高脂对中华鳖肝脏组织中micro RNA及相关基因表达的影响,选取180只中华鳖随机分成两个实验组,分别投喂脂肪质量分数为7.98%(对照组)和13.86%(高脂日粮组)的饲料.定制光周期为12 h光照vs12 h黑暗.饲养6周后,每间隔3 h采集一次肝脏样品,研究高脂对中华鳖micro RNA及相关基因节律性表达的影响.结果表明,中华鳖肝脏组织中3个重要的micro RNA均具有节律性表达特征,且与生物钟核心基因(Clock,Bmal1和Bmal2)和脂肪代谢基因(Lxrα,PPARα和Sirt1)之间具有较强的相关关系.但高脂日粮改变了mi R-1a,mi R-21和mi R-34a节律性表达特征和表达水平,从而引起其相应靶基因(生物钟核心基因和脂肪代谢基因)的昼夜节律表达模式、m RNA表达水平及他们之间的相关关系发生相应改变.该结果为micro RNA参与调控中华鳖肝脏中脂肪代谢相关基因的节律表达提供新视角.     

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

克隆了一个新的人类Lish/CTLH结构域基因,经国际基因命名委员会批准命名为RMND5A.该基因位于染色体2p11.2,长3 239 bp,编码391个氨基酸,其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA.RT-PCR分析表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达,在心脏、肝和肾中的表达水平较强.对该基因的蛋白进行了表达并制备了多克隆抗体.荧光素酶活性测定分析表明,在COS7细胞中过表达蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和AP-1的转录活性显著下降,表明RMND5A通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.     

锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性比较

为研究锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性,采用qRT-PCR技术进行实时荧光定量分析,并用Ge Norm和Norm Finder软件对5个内参基因(RPL13,GAPDH,18 S rRNA,β-actin和RPS29)进行稳定性评估,筛选出不同组织中最适合的内参基因,以准确定量Clock基因的相对表达水平.实验结果表明,5个内参基因中,18 S rRNA在锦鲫的肌肉、心脏、肝脏中表达最稳定,β-actin在肠中表达最稳定,RPL13在肾中表达最稳定;根据筛选的内参基因定量Clock基因的相对表达水平发现,Clock基因在锦鲫肌肉中相对表达量最高,其次依次是肝脏、肾、肠,心脏中最低.本研究准确定量Clock基因,为锦鲫生物钟节律机制的下一步研究奠定了理论基础.     

大鼠睾丸特异表达新基因Lrrc18的克隆及表达谱分析

运用数据库消减杂交(Digital Differential Display,DDD)分析方法,从大鼠睾丸组织中分离出了一个新基因-Lrrc18(GenBank登录号:BC081908).该基因定位于大鼠染色体16p16区带,gDNA在染色体上跨度40 900 bp,含6个外显子,编码一个含256个氨基酸的蛋白,带有4个LRR(leucine-rich repeat domain)结构域.Northern杂交结果显示Lrrc18只在睾丸中表达.对出生后3~56 d不同时期的大鼠睾丸的Lrrc18基因的表达进行检测,结果表明在大鼠出生后21 d时开始在睾丸组织中可检测到Lrrc18的mRNA表达,以后其表达量逐步上升,到42 d时达到最大值.该结果提示:Lrrc18基因在精子的发生过程中可能起重要作用.     

鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)促性腺激素β亚基的克隆、表达和序列分析

促性腺激素(Gonadotropin Hormone, GTH)是垂体合成和分泌的促进性腺发育成熟的一种重要的糖蛋白激素(Glycoprotein Hormones, GPHs).通过RT-PCR方法从鳙(Hypophthalmichthys nobilis)脑垂体中克隆出两种促性腺激素β亚基,分别是促黄体素亚基(Luteinizing Hormone, LH)和促滤泡激素亚基(Follicle-stimulating Hormone, FSH).鳙鱼FSHβ亚基全长645bp,开放阅读框396bp,编码131个氨基酸(GenBank序列登录号:EF552360);LHβ亚基全长559bp,开放阅读框444bp,编码147个氨基酸(GenBank序列登录号:EF565164).根据鳙鱼与草鱼等鱼类及其他脊椎动物FSHβ和LHβ亚基的氨基酸序列分析表明:在鱼类中LHβ亚基具有高度保守性,而FSHβ亚基分化更快.用β-actin内参法从鳙鱼的垂体、下丘脑、心脏、肝脏和性腺等不同的组织,提取总RNA,用RT-PCR技术分析得出鳙鱼FSHβ和LHβ基因仅在垂体中特异性表达.     

IGF1/2在金鱼的不同胚胎发育时期与不同组织中的分化表达

胰岛素样生长因子(insuline-like growth factors,IGFs)是一类具有胰岛素样代谢和促进有丝分裂功能的多肽,包括IGF1和IGF2,对调节垂体生长激素合成和分泌起着重要的作用,同时还参与了细胞的增殖、生长、分化等过程.利用RT-PCR在mRNA水平上检测了IGF1/2基因在金鱼不同组织和不同胚胎发育时期的表达.结果表明,IGF1基因在肝脏中的表达量最高,在大脑、肌肉及精巢的表达量相对较低;IGF2基因在脾脏中的表达量最高,在肾脏、卵巢及精巢的表达量相对较低.IGF1/2基因在不同发育时期基本上呈现由低到高的趋势.研究表明,IGF1/2基因在金鱼的不同组织和胚胎发育过程中可能具有重要的作用,但其具体机制还有待于进一步研究.     

乳腺癌β-catenin表达与细胞凋亡关系研究

探讨β-catenin在乳腺癌组织中与细胞凋亡的关系.免疫组化SP法检测β-catenin、survivin在乳腺癌的表达,TUNEL检测细胞凋亡.乳腺癌组织中31例(68.9%)β-catenin表达异常,33例(73.3%)survivin阳性表达.β-catenin正常表达乳腺癌组织肿瘤细胞凋亡率为(9.89±2.58)%,β-catenin异常表达的肿瘤细胞凋亡率为(7.28±1.86)%,两组有显著性差异(t=3.86,P<0.01).在β-catenin正常表达病例中,42.9%(6/14)survivin表达阳性,而在β-catenin异常表达病例中,87.1%(27/31)survivin表达阳性(表1).β-catenin异常表达与survivin阳性表达有显著的正相关性(rs=0.463,P<0.01).β-catenin在浆、核内聚集的异常表达可能通过激活survivin的表达而抑制乳腺癌细胞的凋亡.     

蒺藜苜蓿SBP-box转录因子基因家族全基因组分析

从全基因组水平研究蒺藜苜蓿SBP-box转录因子基因家族,系统地鉴定出22个SBP-box家族基因,根据基因结构分析、结构域的差异和系统发育分析将这些SBP-box基因分成5个亚家族.基因比较分析表明SBPbox基因家族扩张主要是通过部分复制及串联重复事件来实现的.基因表达模式分析表明蒺藜苜蓿SBP-box基因具有器官特异性并且参与干旱胁迫反应.这些结果为进一步研究蒺藜苜蓿SBP-box家族基因的功能与进化提供理论参考.     

甜菜BvM14-CCoAOMT基因的克隆、表达及生物信息学分析

以甜菜M14品系为试验材料,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了甜菜M14品系木质素合成相关基因咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的c DNA全长。生物信息学分析结果表明,BvM14-CCoAOMT基因具有咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因家族的典型结构域;系统发育分析表明,BvM14-CCoAOMT基因与松叶菊(Mesembryanthemum crystallinum)CCoAOMT基因亲缘关系较近。荧光定量PCR结果表明,BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系的茎中表达量最高,盐胁迫下BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系茎和叶中均显著上调表达。亚细胞定位研究发现BvM14-CCoAOMT蛋白在细胞各个亚细胞部位均有分布。本研究为进一步深入研究BvM14-CCoAOMT基因的功能奠定了理论与材料基础。     

TNFAIP1与RIN3相互作用的鉴定

TNFAIPI是第一个被鉴定能受TNF-α(tumor necrosis factor-α)诱导的蛋白.TNFAIP1基因是一个多功能基因,参与DNA的复制和修复,细胞周期的调控,细胞信号通路转导的调节等.采用酵母双杂交的方法以TN-FAIP1为靶蛋白筛选得到与其相互作用蛋白RIN3.RIN3含有RIN家族多个多功能的结构域,根据RIN3结构域对其分段,研究与TNFAIPI的相互作用.通过免疫共沉淀,荧光共定位一系列细胞证明TNFAIP1蛋白能直接与RIN3相互作用,提示TNFMP1可能参与细胞的胞吞胞吐.     

基于差异共表达分析的肝癌特异性基因的筛选与验证

结合一种新颖的差异共表达分析方法,应用生物信息学工具,在多个肝组织数据集中获取与肝癌相关的基因模块和枢纽基因(Hub gene).传统的差异表达分析方法只关注平均表达水平的差异,忽略了基因共同表达的信息.与传统差异表达分析方法相比,本方法可以有效地从基因相互作用角度识别出肝癌的关键基因.关键基因主要参与了p53、细胞周...     

运用农杆菌介导的瞬时表达体系研究PDS基因沉默

农杆菌介导的瞬时表达体系是一个研究整株植物基因沉默的快速实用系统.本文介绍了运用该系统研究马铃薯X病毒诱导烟草(Nicotiana benthamianan benthamiana)八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因的沉默问题.实验结果表明:携带有与PDS基因同源的409个碱基大小的cDNA片段的重组的马铃薯X病毒载体抑制了内源的PDS基因的表达.     

α-L-岩藻糖甘酶1基因在小鼠不同组织中的表达分析

为了研究不同组织中α-L-岩藻糖苷酶1 (α-L-fucosidase1, FUCA1)特异性表达的调节机制,运用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)在mRNA水平和蛋白水平上分析了Fuca1基因在小鼠成体不同组织中的表达特点,还利用Clustal Omega分析了氨基酸序列在不同物种的同源性和系统进化树。qPCR检测结果显示,Fuca1基因在小鼠不同组织中存在表达差异,在睾丸中表达最高,其次是肾脏与卵巢;而Western Blot检测结果显示FUCA1主要在小鼠肾脏和卵巢高表达;对FUCA1氨基酸序列进行同源性分析,结果显示FUCA1保守性低。以上研究表明,FUCA1可能与小鼠的组织特异性表达调节有关,其在性腺中的具体表达机制还有待研究。     

藜麦WOX转录因子家族的鉴定及表达分析

为揭示藜麦WOX基因家族的功能,为藜麦耐低氮品种的培育提供参考,利用生物信息学方法,对藜麦WOX基因进行全基因组鉴定,并对其理化性质、系统发育、基因结构、保守结构域、保守基序、组织表达和响应氮胁迫的表达进行分析。研究结果表明:藜麦中共有13个WOX转录因子,蛋白长度159～676 aa,相对分子质量18 510～76 730,等电点5.27～9.56;每个成员含有1～4个内含子及2～5个外显子, WOX蛋白都具有由34～60个氨基酸组成的Homeobox保守结构域。系统进化树显示,来源于拟南芥、水稻和藜麦的39个WOX基因分为3组,每一组都含有3个物种的家族成员,同一个物种的WOX基因具有更近的遗传距离。组织表达热图显示,藜麦WOX基因组织表达特异性明显,在茎中的表达量最高,其次是种子和叶,在幼苗中的表达量最低。AUR62031363和AUR62035466对氮胁迫的响应最为显著。     

腺病毒反向重复序列ITRs的人工合成与克隆

为获得高GC含量(72%)的腺伴随病毒AAV反向末端重复序列ITRs(178 bp),以自行设计的4段寡核苷酸引物(约59 bp)为模板,采用融合PCR方法将其人工合成.回收目的片段后,通过TA克隆、PCR和酶切鉴定获得8个阳性转化子.经测序鉴定,得到了5个序列完全正确的克隆.本实验为研究含有ITRs的重组杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达持续时间的影响奠定了基础.     

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱

为了深入研究GAS41在胚胎发育中的作用机理,应用生物信息学软件分析了斑马鱼GAS41基因的序列特征;采用RT-PCR、整体原位杂交和整体免疫组织化学方法检测其在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱.结果显示斑马鱼GAS41蛋白与人类、小鼠、大鼠同源蛋白都有91.2％的同源性,具有高度的保守性.RT-PCR结果表明GAS41在检测的成体组织中均有表达,表达丰度相当.而GAS41在胚胎受精后一直持续表达,其中受精4h后表达量升高.整体原位杂交和免疫化学结果显示GAS41特异性表达于胚胎头部,尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显.这些都提示GAS41是一个高度保守基因,在斑马鱼中枢神经系统发育过程中可能起重要作用,同时也为GAS41在胚胎发育调控中的作用机制提供实验基础.