应用噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的可行性研究

探讨了应用哈维氏弧菌噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的方法和可行性.实验表明,从对虾育苗场分离的哈维氏弧菌噬菌体对对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的噬菌作用具有相当高的特异性,它不能裂解同样来源的溶藻弧菌、副溶血性弧菌、光合细菌,却能特异地裂解本实验所用的不同来源的哈维氏弧菌,噬菌斑出现率可达80%~100%,并且噬菌斑的出现率与虾苗发生发光病的发病程度有一定的相关性,可应用于哈维氏弧菌的检测和对虾发光病致病菌的诊断.     

华南地区海水养殖水域中哈维氏弧菌的抗药性分析

为了解和分析中国华南地区主要海水养殖水域中哈维氏弧菌的抗药性,本文研究了该地区海水养殖水域的41株哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)对40种常见抗生素的耐药性,并作了聚类分析,探讨了耐药性同菌株的时空分布关系.结果显示:41株菌均对阿米卡星耐药,其对40种抗生素的耐药率为4.9%~100%,所有菌株对40种抗生素的多重耐药比率在27.5%~95.0%之间,对30种以上抗生素耐药的菌株有15株;耐药谱型有41种,三亚、文昌、深圳、临高、陵水、湛江等地区的分离菌株分别含有11,11,3,3,1,12种耐药谱型,这5个地区的共同耐药谱为:莫/氨/强/青/咪/丁;2010年、2011年、2012年、2013年、2015年的分离株分别具有4,5,5,24,3种耐药谱型.于聚类分析中,在欧式距离的平方为2时,实验菌株可分为Ⅰ~Ⅶ7个亚群,分别含有9,5,9,5,2,10,1种耐药谱型,耐药量最少的是亚群Ⅴ,共11种,最多的是亚群Ⅶ,共19种;在欧式距离的平方为8时,菌株可聚类为Group Ⅰ、Group Ⅱ两个组群,这两个组群的菌株对麦/利/罗/左/环/壮/恩/吩/新9种抗生素的敏感性存在明显差异,Group Ⅰ菌株的耐药种类明显多于Group Ⅱ菌株的耐药种类,并且其耐药谱型更多.实验结果表明:中国华南地区海水养殖水域中的哈维氏弧菌具有严重的多重耐药性,哈维氏弧菌分离株的耐药谱型多样性,对于来源不同的菌株,其耐药谱型存在差异,耐药性聚类分析方法是对这些菌株的一种有效分型手段.     

哈维氏弧菌黑鲷分离株BK-1培养条件优化研究

从患病黑鲷Sparus macrocephalus 的肾脏分离到一致病菌株BK-1,经鉴定为哈维氏弧菌.对哈维氏弧菌BK-1株的最佳生长条件及培养基优化进行了测定.结果表明:不同的培养条件和培养基成份均会影响其产量.哈维氏弧菌最适宜生长条件为:盐度为2%、pH8、温度为30℃;最佳培养基成份为:蛋白胨0.5%,牛肉膏0.75%,甘油0.05%,CuSO40.15 mg/L,CaCl2 0.01 g/L.     

特异性检测卵形鲳鲹源哈维氏弧菌的核酸适配体的筛选与鉴定

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖动物常见的主要致病菌之一,严重危害着我国华南沿海地区水产养殖业的健康可持续发展.针对哈维氏弧菌的快速检测诊断技术和抑菌技术等方面进行系统研究,并开发具有市场发展潜力的快速检测试剂盒和抗菌功能产品,对控制哈维氏弧菌的危害极其重要.为此,本研究以哈维氏弧菌为靶标,利用指数...     

哈维氏弧菌TS-628菌株抗原性研究

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼虾养殖中常见的致病菌,由该菌引发的病害给世界各地的养殖业带来重大经济损失,但对其有效抗原的筛选或相关疫苗的研究报道相当少,对其病害的防治也尚无有效措施.本文以患病青石斑鱼分离到的病原菌哈维氏弧菌TS-628菌株为研究对象,分别提取它的鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP),并采用Western blot技术分析检测这3种成分的抗原性.结果显示,鞭毛蛋白主要的免疫印迹带约有4条,其中43、52 ku为主要免疫反应显色带;OMP主要的免疫印迹带约有5条,其中43 ku为最主要免疫反应显色带, 35、38、47和52 ku也具有较强的免疫显色反应.LPS没有检测到免疫印迹反应.这一研究结果将为灵敏检测哈维氏弧菌以及研制高效疫苗奠定基础.     

低盐度地下水中国对虾仔虾放养的成活率

1999年5月,将体长为0．65cm的中国对虾(Penaeuschinensis.)仔虾分别放养在盐度为22‰和16‰的2种半咸地下水(简称地下水)和盐度为32‰的海水中3d后,仔虾成活率出现显著差异;而放养在加盐调配成盐度为26‰的地下水和盐度为32‰的海水中3d后,成活率无显著差异．体长为1．1cm的中国对虾仔虾在盐度分别为32‰的海水、16‰的未经处理的地下水、16‰的氧化处理的地下水、26‰加NaCl调节的地下水和26‰的加卤水调节的地下水中养殖4,8,12d后,成活率差异不显著．试验证明,体长为0．65cm的中国对虾仔虾对低盐度(16‰～22‰)地下水的适应能力较差,不能直接放养于池塘;体长1．1cm的中国对虾仔虾可直接在盐度16‰以上的地下水中放养．     

中国对虾育苗池水中哈维氏弧菌的检测

１９９６年４月～５月,在山东莱州市在大华育苗池,山东即墨市丰城育苗场发病发育池,环境水体及活体饵料中共采集８０份样品,用间接ＥＬＩＳＡ技术对其进行苗期对虾病原菌－哈维氏弧菌的检测,结果表明,发病育苗池中哈维氏弧菌的检出率（５８．３％）明显高于正常育苗池（２０．４％）,证实丰城对虾育苗场暴发的流行病与育苗水体中的哈维氏弧菌有关,大华育苗场育苗水中也检测出哈维氏弧菌,但大华育苗场未发病,说明哈维氏弧菌     

一株铜绿假单胞菌的分离鉴定及其对VPAHPND拮抗效果的评价

近年来，急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)造成了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖业巨大的经济损失，其病原为一类含有致病基因PirAB的弧菌(Vibrio),主要为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP_AHPND).本研究以VP_AHPND为受试菌株，从江苏海域捕获的黄姑鱼(Nibea albiflora)体内分离筛选对VP_AHPND具有抑制作用的拮抗菌株.通过形态学、生理生化及分子生物学方法进行鉴定，研究了其拮抗效果、拮抗活性物质，并对生物安全性和被动保护效果进行评估.结果表明，分离筛选出1株具有良好拮抗效果的菌株JSHY97,经鉴定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa).该菌株对3株具有不同分型的VP_AHPND均具有良好的拮抗效果，其抑菌圈直径达19.25 mm～21.80 mm,初步判断其活性物质来源于胞外产物.口服JSHY97的凡纳滨对虾...     

南美白对虾虾苗淡化期间发光病病原研究

2002年,浙江某南美白对虾(Penaeusvannamei)苗种场在虾苗淡化过程中发生了发光病.通过对典型发光病虾的镜检、细菌分离,结果从濒死病虾体内分离到4株细菌,其中菌株Pv-1在TCBS和TSA培养基上均能发光,用此菌株浸泡感染健康南美白对虾,可复制出发光病虾,且有较高的死亡率。对Pv-1进行了培养特性和生化特性鉴定,确定Pv-1为革兰氏阴性菌,菌体呈直杆状,大小为1.5μm×0.8μm,极生单鞭毛运动,氧化酶阳性,发酵葡萄糖,对弧菌抑制剂0 129(150μg)敏感,经鉴定为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi).由此表明哈维氏弧菌为此次南美白对虾虾苗淡化期间发光病的病原.     

网箱养殖鲈鱼内脏白点病病原的分离与鉴定

2007年5-6月,浙江省象山港海区网箱养殖鲈鱼暴发一种较为严重的传染性疾病.从自然发病和人工感染患病鲈鱼分别分离到LY-1、LY-2菌株.采用常规生理生化指标测定和分子生物学16S rRNA测序分析对病原菌进行分类学鉴定,两者鉴定结果一致并初步确定LY-1、LY-2均为哈维氏弧菌Vibrio harveyi.HSP60序列分析表明,所测病原菌HSP60基因序列与Vibrio harveyi同源性为99%,而与其他弧菌属细菌HSP60基因的同源性均小于91%.综合上述结果,LY-1、LY-2菌株被鉴定为哈维氏弧菌.     

盐度对凡纳滨对虾、中国明对虾和斑节对虾仔虾生长和存活的影响

为开发渤海滩涂对虾养殖业,研究盐度(30‰和45‰)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和斑节对虾(Penaeus monodon)仔虾生长和存活的影响.结果表明,经过10周的室内养殖,除斑节对虾外,凡纳滨对虾和中国明对虾在不同盐度下生长无显著差异(P>0.05).凡纳滨对虾无论是在盐度30‰或45‰,其生长和成活率均显著高于中国明对虾和斑节对虾(P<0.05),表明凡纳滨对虾更适于高盐环境养殖.     

中国对虾血淋巴抗菌活力的测定

采用溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、哈维氏维菌、嗜水气单胞菌对中国对虾血浆样品、血细胞溶解物（ＨＬＳ）样品的抗菌活力进行了测定。表明中国对虾血浆样品对四种细菌均表现出一定的抗菌活力。其中,三种弧菌活细胞数在孵育１ｈ时呈现最低;嗜水气单胞菌活细胞数在孵育４ｈ时最少,在三种弧菌中,血浆样品对哈维氏弧菌表现出的抗菌活力最强,而对副溶血弧菌表现出的抗菌活力最弱。血细胞溶解物样品对三种弧菌几乎没有表现出抗菌活力;嗜     

海洋生境枯草芽孢杆菌LHB02抗菌蛋白的分离纯化及部分特性分析

LHB02是一株分离自海滩污泥的海洋生境枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其发酵产物对海水养殖常见致病菌弧菌有很强拮抗能力.采用硫酸铵沉淀、Sephadex G-50凝胶层析等方法,进一步对LHB02发酵产物分离纯化,获得了分子质量为47 ku单一条带的糖蛋白.经抗菌活性分析及稳定性测试发现,纯化后的抗菌蛋白对哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)有很强的抑制作用,对热稳定及酸的耐受性也比较强(pH 3.0~8.0),但对部分蛋白酶敏感.LHB02所产抗菌蛋白的强抑菌作用和高稳定性,预示着该菌可作为一种生防细菌开发,用于大黄鱼养殖中弧菌病的防治.     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明:通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

引起舟山地区凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病病原的分离与鉴定

2014-2019年期间,从舟山地区疑似发生急性肝胰腺坏死综合病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)对虾体内共分离到30株病原菌。通过16S r RNA基因及gyrB、rpoA等基因同源性检索分析对30株分离菌进行了鉴定;同时运用Nested-PCR方法筛选并鉴定了菌株pirABVP基因携带情况;选取代表性菌株,以浸泡感染方法进行了致病性试验。分离菌鉴定结果显示:从舟山地区凡纳滨对虾肝胰腺中分离到的病原菌主要以副溶血弧菌、坎贝氏弧菌及欧文斯氏弧菌为主;其中10株菌携带pirABVP毒力基因;本实验选取4株pirABVP基因阳性菌和1株pirABVP基因阴性菌进行了感染试验;致病性试验显示,携带pirABVP毒力基因的4株菌可使健康对虾发病,出现急性肝胰腺坏死病的典型症状,且持续暴露于病原菌的实验对虾的最高死亡率可达95%,比短时间暴露组死亡率高40%左右;发病虾肝胰腺及肠道组织出现了肝胰腺小管崩塌及肠绒毛脱落等严重的病理变化。研究表明,携带pVA1质粒的副溶血弧菌、欧文斯氏弧菌和坎贝氏弧菌等多种弧菌诱发了舟山地区对虾AHPND,养殖环境中的AHPND致病菌持续存在会导致对虾死亡率处于高水平状态。     

海南地区养殖石斑鱼皮肤溃疡病病原的分离、鉴定、药敏分析及病理学研究

2016年,针对海南岛沿岸9个石斑鱼养殖场的石斑鱼皮肤溃疡病的调查发现,该疾病的发病面积广、死亡率高,对养殖产业的危害严重.从9个采样点3种患病石斑鱼样品的组织中分离得到了9株优势菌株,人工回感试验表明,其感染特征与自然病症一致,证明这9株菌均为皮肤溃疡病的致病原,在经过生理生化和16S r DNA序列分析后,这9株菌均被鉴定为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi).人工回感试验证实,菌株SY-1对珍珠龙胆石斑鱼的毒力最强,其14天每克鱼体重的半致死剂量(LD50值)为7.18×10~4cfu;药敏实验的分析表明,这9株病原菌对34种抗菌药物的药敏谱基本一致,但对氟苯尼考、强力霉素、四环素等药物高度敏感;病理学的研究表明,患病鱼的鳃丝、皮肤、肌肉、肝脏、脾脏、肾脏、肠道和脑等组织器官都发生了不同程度的病理变化,因此认为该病为全身性感染.本研究表明,目前海南地区养殖石斑鱼皮肤溃疡病的致病原有较高的病原同一性,主要为哈维氏弧菌;而较早报道的溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病菌的优势度大大降低了,其致病力有所下降,并且与海南地区养殖石斑鱼皮肤溃疡病的相关度不大.     

一种引起脊尾白虾红体病病原菌的初步研究

2012年7月,浙江舟山某试验场暂养的脊尾白虾暴发一种较为严重的传染性疾病,病虾身体发红,额剑发黑,反应迟钝,摄食减少,一周内发病死亡率达到30%左右,并有迅速蔓延趋势。从病虾的血淋巴液和肝胰腺中分离到一株优势细菌XS1207005。人工感染试验结果表明,该菌株对健康脊尾白虾有较强的致病性,且感染发病的脊尾白虾与自然发病虾有相同的临床症状,确定该菌株为脊尾白虾红体病的病原菌。采用常规生理生化指标测定、16S rDNA和热激蛋白HSP60(heat shock protein)基因序列分析对病原菌进行分类鉴定,序列分析结果表明,16S rRNA基因序列与弧菌属相应的序列同源性最高;HSP60基因序列与哈维氏弧菌相应的序列同源性为99.6%,而与其他弧菌属细菌的HSP60基因同源性均小于91%,结合生理生化测定结果,确定菌株XS1207005为哈维氏弧菌。药敏试验结果表明,先锋噻肟、复方新诺明、利福平、先锋必、菌必治、氟哌酸、复方欣及氧氟沙星等8种药物对该菌株有明显的抑制作用。     

金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治

从具有肠道糜烂、肛门突出体外病症的金鲳鱼(Trachinotus ovatus)体内筛选致病菌株,分离纯化获得菌株05A。通过活菌注射金鲳鱼腹腔回归感染试验,确定菌株05A为致病菌株。经单菌落形态特征、生理生化指标以及16S rRNA分子鉴定,确定其为哈维氏弧菌(Vibro harveyi)。中草药的体外抑菌实验表明,大蒜、儿茶、五倍子和石榴皮等4种中草药对病原菌05A有较好的抑菌效果,其次是仙鹤草、黄连、黄芩、甘草、大黄、五味子和诃子。     

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^-1 IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni²⁺亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320 000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致...     

斑节对虾仔虾对低盐度海水耐受力的研究

在室内条件下,对斑节对虾(Penaeusmonodon)仔虾耐受低盐海水能力的实验研究结果表明全长12mm的仔虾在每天递减盐度10％,20％和30％3种条件下,其LC50下限盐度为3‰～4‰,存活时间分别为11,5和2．5d．较大个体(全长17mm)的仔虾其耐受低盐的能力更强．文中讨论了对虾仔虾对低盐度海水耐受力的机制以及在对虾养殖中意义．