ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC对α9α10乙酰胆碱受体的活性研究

分析和检测了ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC对α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)的结合活性,并用重组表达在非洲爪蟾卵母细胞膜上的大鼠α9α10 nAChR受体,分别评价了2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在常规的ND96灌流液和不含钙离子的钡离子ND96灌流液(Ba2+ND96)中对该受体的阻断活性.研究表明,2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在Ba2+ND96灌流液中对α9α10 nAChR没有抑制作用,而它们在常规的ND96灌流液中却表现出微弱的抑制活性,这应是受钙离子激活产生的氯离子电流影响的结果.因此,2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC并不是α9α10 nAChR的有效阻断剂,其作用机理与α-芋螺毒素Vc1.1和Rg IA完全不同.本研究阐明了芋螺毒素抑制α9α10 nAChR和钙离子通道的机理,这对研发新型的芋螺毒素镇痛药和更好地治疗顽固性疼痛具有很重要的科学意义.     

α6/α3β2β3乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达及其条件优化

为建立有效的α6/α3β2β3 nAChRs(α6/α3β2β3,或简写为α6β2^*,*代表其他亚基)体外重组表达实验模型,利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系,采用显微注射RNA的方法,利用双电极电压钳技术检测电流,对α6/α3β2β3nAChRs亚型进行体外重组表达研究,并对其表达条件进行优化,获得了α6/α3β2β3 nAChRs优化的重组表达体系.烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是一类重要的配体门控离子通道,其亚型众多且结构相似,但各亚型的生理学和药理学功能截然不同.天然的α6β2^*nAChRs很难体外表达,体外表达模型的表达电流非常小.因此,本实验拟研究优化该亚型的表达,进行优化后的体外表达模型,产生的激发电流显著提高,为以该亚型为靶点的新药筛选提供实验模型和基础.     

芋螺毒素国内外研究现状

芋螺毒素(conotoxins)是芋螺捕食与防御过程中的主要武器,是一类多数由10～40个氨基酸组成的活性多肽,具有分子量小、结构稳定、序列超变异、作用靶点广泛、功能专一等优点。现已发现的芋螺毒素七大超家族能特异性地作用于体内钾、钠、钙等多种离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激肽的受体,从而干扰细胞或神经中的信号传递,有很强的生物学活性。既可以作为体内各种离子通道、受体类型及其亚型分类和鉴定的靶点探针,也可被设计作为药物的导向化合物或直接开发和筛选成为疗效特异的高效新药。本文总结了目前国内外芋螺毒素的研究现状。     

蜈蚣粗毒中多肽毒素组分生理活性初步分析

几乎所有蜈蚣都是肉食动物,都依靠其毒液来捕杀和消化猎物,蜈蚣粗毒为混合物,其主要成分为蛋白质.本文以蜈蚣粗毒为原料,通过反相高效液相色谱进行分离纯化,将纯化产物进行MALDI-TOF-MS鉴定,发现蜈蚣粗毒中具有多肽组分.收集多肽组分在DRG细胞上进行全细胞膜片钳电生理实验研究,发现其中4个组分具有抑制电压门控钠通道电流活性、4个组分具有抑制电压门控钾通道电流活性.表明蜈蚣毒素具有很好的开发应用前景,为后续工作打下了良好的实验基础.     

脯氨酸羟基化促进芋螺毒素lt3a的氧化折叠

毒素lt3a是从信号芋螺毒管中分离鉴定到的一种天然多肽,天然来源的lt3a的第6位脯氨酸发生了羟基化修饰。为深入研究脯氨酸羟基化的生物学意义,以lt3a中第6位脯氨酸为研究目标,采用固相化学合成的方法分别合成了不含羟基化修饰的多肽lt3a和具有羟脯氨酸的多肽lt3a[P6O],并对其氧化折叠速率、热稳定性和功能进行了研究,发现在GSSG/GSH溶液中,lt3a[P6O]的氧化折叠速率是lt3a的两倍,但两者的折叠终产率相当,进一步实验表明羟脯氨酸的存在不影响lt3a的热稳定性和对神经干复合动作电位的作用。说明羟脯氨酸促进了lt3a的氧化折叠速率,但对其生物学活性没有显著影响。该研究一方面为芋螺多肽翻译后修饰研究奠定了基础,另一方面对芋螺毒素的结构改造提供理论依据。     

玉米源活性肽的分离纯化及清除DPPH自由基的活性

以脱脂醇溶蛋白为底物进行酶水解反应,获得了玉米源活性肽组分,经葡聚糖凝胶和离子交换等方法对产物进一步分离纯化.以α-生育酚为阳性对照,研究了活性肽及其分离纯化组分对2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)自由基的清除活性及其浓度的关系.结果表明:活性肽及其分离纯化组分均具有清除DPPH自由基的活性;经CM-纤维素弱阳离子交换层析分离所得组分2对DPPH自由基的清除活性最强,且清除效果与其浓度及作用时间呈正相关,分子量主要集中在400～700.     

芋螺毒素lt1c的重组表达及镇痛功能

lt1c是从信号芋螺毒管中发现的一种A超家族毒素多肽,为深入研究其功能,采用pTRX表达系统将lt1c与硫氧还蛋白基因进行融合,转入大肠杆菌进行表达后,通过超声破碎、亲和层析、酶切和凝胶过滤层析等方法,最终得到目的蛋白。组织水平的青蛙坐骨神经-腓肠肌活性研究表明,重组表达的lt1c在6μmol/L浓度下,30 min内完全抑制肌肉的收缩,且其作用可逆。进一步的功能研究发现,lt1c能够抑制热板疼痛模型小鼠的舔足反应,提示A超家族芋螺毒素lt1c可能具有一定的镇痛活性。该研究为筛选新的多肽镇痛药物奠定了基础。     

芋螺毒素（conotoxins）的研究进展

芋螺毒素是近年来研究得较多的一类海洋生物神经毒素,化学结构独特,是约含10－30个氨基酸残基的小肽,能特异地与神经受体结合。本文介绍有关芋螺毒素的发现,神经作用研究及分子生物学研究等方面的研究历史,及其在神经生物学和新药开发等方面的应用前景。     

虎斑颈槽蛇大陆亚种颈背腺体毒液中金属蛋白酶RT-2组分的分离及其性质测定

通过离子交换和凝胶过滤层析的方法,从虎斑颈槽蛇大陆亚种(Rhabdophis tigrinus lateralis)颈背腺体毒液中分离纯化得到一金属蛋白酶RT-2组分,SDS-PAGE电泳显示为单一条带,分子量为81kDa.以酪蛋白为底物测得其蛋白质水解酶比活力为0.56 U/mg,最适作用温度为40 ℃,最适pH为8;Ca2 和Zn2 对其活性有增强作用;EDTA,EGTA,β-巯基乙醇对酶活力有明显的抑制作用,而PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)对酶活力的影响相对较小; RT-2组分无磷脂酶A、5'核甘酸酶、碱性磷酸单酯酶和磷酸二酯酶活性;也无水解纤维蛋白(原)活性和凝血活性;RT-2组分不诱导小鼠皮下出血.     

芋螺毒素(conotoxins)的研究进展

芋螺毒素是近年来研究得较多的一类海洋生物神经毒素,化学结构独特,是约含10～30个氨基酸残基的小肽,能特异地与神经受体结合.本文介绍有关芋螺毒素的发现,神经作用研究及分子生物学研究等方面的研究历史,及其在神经生物学和新药开发等方面的应用前景.     

山茱萸中生物活性物质的分离、鉴定及其神经保护作用

研究山茱萸乙醇提取物中生物活性成分的化学组成及其对神经的保护作用。采用正相常压硅胶、Sephadex LH-20凝胶、大孔吸附树脂、闪式低压正反相硅胶和氰基、反相高压液相等色谱方法对显示具有神经保护活性的组分进行分离纯化,根据核磁共振谱、质谱,同时结合已知文献数据对比鉴定化合物结构;再采用H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型对分离鉴定的化合物进行体外神经保护活性测定。结果表明,从山茱萸显示神经保护活性的组分中分离鉴定了9个化合物,分别为7-β-莫诺苷(1)、7-β-O-甲基莫诺苷(2)、7-α-0-甲基莫诺苷(3)、金吉苷(4)、cornolactones D(5)、pollenfuran A(6)、threo-2,3-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol (7)、5-羟甲基糠醛(8)和3,4-二-羟基苯甲酸(9);其中化合物pollenfuran A(6)和threo-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol(7)为首次从山茱萸属植物中分离得到,化合物cornolactones D(5)为首次从山茱萸中分离得到;化合物7-β-莫诺苷(1)、7-β-0-甲基莫诺苷(2)、7-α-0-甲基莫诺苷(3)具有神经保护活性。     

过山枫根化学成分研究

从卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属植物过山枫(Celastrus aculeatus Merrill)的根中分离纯化并鉴定了4个化合物,其结构分别为Celastrol(1)、Trans-hydroxycinnamoyl ester of lupeol(2)、β-sitosterol(3)和1β-benzoyl,2β-benzoyl,6α-2-methyl-butyryl,8β-hydroxyl,9α-acetylβ-dihydroagarofurane(4).其中化合物2、4为首次从该植物中分离得到.     

对于αO-芋螺毒素GeXIVA[1,2]安全性的评价

为了初步评价αO-芋螺毒素Ge XIVA[1,2]的安全性,以昆明种(KM)小鼠为受试动物,于给药组连续7天对每只小鼠肌肉注射10 nmol的αO-芋螺毒素Ge XIVA[1,2],对照组则给予等容积的生理盐水.实验期间监测小鼠的体重变化,观察小鼠的毒性反应,给药结束后,即第8天摘除其眼球并采血,检测小鼠的血常规、血液生化等指标,同时剖取其主要脏器,称重后计算脏器系数,并以此来评价Ge XIVA[1,2]的毒性作用,然后对该药物剂量的安全性进行初步评价.结果显示:Ge XIVA[1,2]组的小鼠与生理盐水组相比较,小鼠活动正常,且未见明显的毒性反应或死亡现象;实验期间给药组小鼠在各个观察时间的体重与对照组比较均未发现显著性差异(P0.05);给药组与阴性组在血常规检查、血生化检测、脏器系数(%)等方面均无显著性差异(P0.05).由此认为,在本实验剂量范围内,αO-芋螺毒素Ge XIVA[1,2]的安全性好,且无明显的毒副作用.     

大肠杆菌诱导家蚕蛹免疫血淋巴中抗菌物质的分离、纯化与鉴定

本文报道了经大肠杆菌(E.Coli)诱导后的家蚕蛹.其免疫血淋巴用CM—Sepharose离子交换层析法可分得4个组分的活性物质,分别为α、β、γ和δ,其中β组分含量较多,纯度较高。将β组分再经Phenyl—Sepharose疏水层析进一步分离纯化后的样品,经酸性垂直平反聚丙烯酰胺疑胶电泳鉴定为单一条带,SDS—聚丙烯酰胺疑胶电泳鉴定也为单一组分,分子量约为3600道尔顿,均一性好,100℃加热30分钟乃有抑菌活力。同时亦观察了该组分紫外及收光谱的特征。     

拟南芥PP2A B′调节亚基β亚型抗体的制备及鉴定

拟南芥中,蛋白磷酸酶2A(PP2A)B′调节亚基有9个亚型,其中α亚型和β亚型是油菜素内酯(BR)信号通路的正调节子,它们能使转录因子BZR1脱磷酸化.选择β亚型特异的一段多肽P109,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了连有HIS标签和GST标签的融合蛋白HIS-P109和GST-P109.以HIS-P109作为抗原,免疫新西兰兔,获得抗体,然后用GST-P109对抗体进行了亲和纯化.利用此纯化的抗体在不同的拟南芥材料中免疫印迹检测β亚型蛋白的表达,证实制备的抗体能与拟南芥PP2AB′调节亚基β亚型特异性反应,为深入研究PP2A在BR信号转导途径中的功能提供了有力工具.     

广东凉茶颗粒苷类化学成分研究

为进一步阐明广东凉茶颗粒的药效物质基础和完善其质量标准,首次对其化学成分进行系统研究。从其甲醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到5个苷类成分,采用物理常数对照和现代波谱分析方法确定其结构依次为:4-p-香豆酸-D-吡喃葡萄糖苷(1)、2α,3α,19α-三羟基乌苏-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、2α,3β,19α-三羟基乌苏-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖(3)、2α,3β,19α,23-四羟基乌苏-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、木犀草素-6-C-葡萄糖苷(5)。1为首次得到的天然产物,1,2,3,4,5均首次从广东凉茶颗粒中分离得到,为进一步研究其药效及药理活性打下基础。     

水溶性海参皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

从冻干仿刺参加工废弃液中分离纯化出水溶性海参皂苷,筛选并纯化出其强抗真菌活性组分,为利用水溶性海参皂苷研制高效抗真菌药物创造条件. 先后利用大孔树脂柱层析和硅胶柱层析对水溶性海参皂苷进行了纯化,并对各种纯化组分的抗真菌活性进行了测定. 在30%,50%,70%,80%,95%乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中,70%乙醇溶液洗脱组分对裂殖酵母菌和白色念珠菌的抗真菌活性最强. 70%乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后,得到了SC-1、SC-2、SC-3和SC-4四种纯化样品,除SC-1无抗真菌活性外,其它3种纯化样品对裂殖酵母菌和白色念珠菌均具有显著的抗真菌活性,且组分SC-2和SC-3的抗真菌活性高于SC-4. SC-2纯化样品在高压液相柱层析（HPLC）图谱中仅显示为单一洗脱峰,且在旋转蒸发后可形成结晶,表明其纯度极高,可用于高效抗真菌药物的研制.     

水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

为了分离纯化出具有强抗真菌活性的水溶性海星皂苷,以罗氏海盘车(Asterias rollestoni)腕为实验材料,利用水抽提方法获得水溶性海星皂苷粗品,依次利用大孔树脂和硅胶柱层析对水溶性海星皂苷进行了纯化,并对其抗真菌活性进行了测定。研究结果发现,在30％、50％、70％、80％、95％乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中,70％乙醇溶液洗脱组分对白色念珠菌和裂殖酵母菌的抗真菌活性最强。70％乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后,得到了SF-1、SF-2、SF-3和SF-4四种纯化样品,其中SF-1纯化样品没有抗真菌活性,SF-2纯化样品具有极弱的抗真菌活性,SF-3和SF-4纯化样品均具有很强的抗真菌活性。SF-3纯化样品在高压液相柱层析(HPLC)图谱中仅显示单一洗脱峰,表明其纯度很高,可应用于高效抗真菌药物的研制。研究结果为利用水溶性海星皂苷研制高效抗真菌药物奠定了基础。     

广西龙血竭游离黄酮类化合物的分离鉴定及活性研究

根据血竭中游离黄酮存在着酸性差异,采用溶剂除杂,转溶于乙醚,再用pH梯度萃取得到不同酸性的黄酮,进而对弱酸性组分分离纯化得到2个单体化合物.通过考察不同提取部位对α-D-葡萄糖苷酶抑制活性的变化,发现弱酸性成分的活性较强,比血竭全粉提高45.5%,为研究龙血竭中黄酮类化合物对α-D-葡萄糖苷酶的抑制作用提供依据.     

蛋白激酶C对转录延伸正调节因子b(P-TEFb)的影响

本文探讨了PKC的4种亚型α、βⅡ、γ和λ对PTEFb各蛋白组分的表达影响.成功构建了带有HA标签的pcDNA3.1 PKC的各亚型真核表达载体,并转染HEK293细胞株,用Western bolt检测其表达情况,发现这四种PKC亚型在细胞中表达良好。将PKCβⅡ或者PKC λ转染进入HEK293细胞株 ,发现其可使CDK9和Cyclin T蛋白表达量升高;但在细胞中高表达PKCα和PKCγ,对P-TEFb各组分表达量没有影响.表明PKC可通过提高P-TEFb的组分表达量,从而上调某些基因的表达.