植物抗冻蛋白的生物化学研究进展

抗冻蛋白是一种能抑制冰晶生长的蛋白质或糖蛋白质．自二十世纪60年代发现以来，研究对象先后从极区鱼类、昆虫转移到植物材料上．抗冻蛋白包括抗冻糖蛋白、抗冻蛋白Ⅰ、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ、抗冻蛋白Ⅳ．简要介绍了植物抗冻蛋白的生化特征、抗冻机制及其应用研究，并对抗冻蛋白的基因工程作了系统综述．     

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白的克隆及表达

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白（ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ）的克隆和表达,是研究抗冻蛋白抗冻机制的重要步骤之一,有助于揭示抗冻蛋白分子结构与活力的关系．用 Ｐ Ｃ Ｒ 法获得 ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ 基因片段,构建了分泌型表达载体 Ｐｌａｃ Ｉ Ｑｐａｒ８ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ．用 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 法测其表达水平,氨基酸组成分析及质谱分析证明表达的蛋白与天然蛋白完全一致,并具有天然蛋白相同的活力．     

抗冻蛋白活性的吸附动力学模型

根据抗冻蛋白溶液中抗冻蛋白分子与冰晶表面相耳作用特点，提出抗冻蛋白与冰晶表面相互作用模型。进而，利用饱和分数与抗冻活性之间的关系，给出抗冻活性与抗冻蛋白浓度的理论关系。根据此关系做出了与实验数据符合较好的抗冻活性与抗冻蛋白浓度关系的理论曲线。另外，对抗冻蛋白分子与冰晶表面相互作用的特点作了进一步的讨论．     

抗冻蛋白的作用机制及基因工程研究进展抗冻蛋白的作用机制及基因工程研究进展汪少芸

分析了抗冻蛋白的作用机制及基因工程的研究进展.抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质.近些年的工作主要集中在该类蛋白质抗冻机制及基因工程的研究上.抗冻蛋白具有广泛的应用前景,它不但可以应用于食物的冷鲜贮存及移植器官的低温保存,还可通过转基因提高经济作物的抗冻能力.     

鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的生物学活性

为了通过细菌低温保护实验测定鱼源Ⅲ型抗冻蛋白（AFPⅢ）对大肠杆菌的低温保护效果,利用前期构建的原核表达质粒pET32a（＋）-AFPⅢ转化大肠杆菌,目的蛋白以融合his标签的形式在大肠杆菌中表达,经NI柱亲和层析得到较高纯度的AFPⅢ-his融合蛋白。细菌抗冻实验的结果表明,外加一定浓度范围内的纯化的AFPⅢ融合蛋白对细菌有明显保护作用,但是抗冻蛋白的浓度对细菌的保护力不成一致的线性关系。鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的浓度在50μg／mL时抗冻效果最好,并且随着温度的下降,抗冻蛋白对细菌的保护能力与Glycerol对细菌的保护能力的差距逐渐减少,在-80℃时基本可以代替甘油用于菌种保存。     

鱼抗冻糖蛋白AFGP7—8的热滞研究

分析了鱼抗冻糖蛋白（ＡＦＧＰ７－８）的结构特点及在溶液中的特性，计算了ＡＦＧＰ７－８溶液的热滞，理论结果与实验数据较好地符合。     

冬鲽鱼抗冻蛋白基因的人工合成

合成适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白（Winter flounder antifreeze protein,Wf-AFP）基因.参照冬鲽鱼抗冻蛋白的氨基酸序列及棉花偏爱的密码子,重新设计适合在棉花中表达的Wf-AFP基因序列;根据此序列设计6条寡核苷酸引物,通过PCR方法将其拼接成完整的基因;克隆到pUCm-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组子进行酶切鉴定及序列分析.结果表明合成的Wf-AFP基因序列与设计方案完全相符,通过PCR介导的基因合成方法成功获得了适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白基因.     

抗冻蛋白基因转化植物的研究展望

重新评估了用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草的研究，认为植物耐寒性状的提高与转基因植物中冻抗蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷冻诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害，因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

抗冻蛋白及其对冰晶生长的影响

抗冻蛋白具有特殊的热迟滞性质，即其冰点低于熔点，且能抑制冰晶的生长．本文综述了在耐寒鱼、昆虫体内以及最近二三年在植物、真菌、细菌等生物中发现的抗冻蛋白，分析其结构及其对冰晶生长的影响，并寻求抗冻蛋白在细胞、生物组织的低温保存中可能的应用途径．     

胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆及其在E.coli中的表达

对中国的一个胡萝卜品种进行了冷诱导前后幼苗总蛋白组成的比较、分析 ,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明两者在相对分子质量 36 0 0 0附近有一条蛋白带的差别。由此推测实验的胡萝卜品种在冷诱导过程中有抗冻蛋白 (AFP)表达。根据相关的研究结果设计引物 ,以胡萝卜幼苗基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增得到了长 10 99bp的抗冻蛋白基因。测序结果表明其与GenBank公布的afp序列仅有 3个碱基的差别。将此抗冻蛋白基因克隆进大肠杆菌表达载体pGEX4T1,在IPTG的诱导下表达出了含有AFP的约 6 0 0 0 0的融合蛋白 ,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达     

鱼抗冻蛋白溶液的热滞与蛋白分子量的关系

分析了鱼抗冻糖蛋白的抗冻机理，根据冰晶生长理论和Ｆｌｏｒｙ的大分子溶液理论，导出了抗冻糖蛋白的热滞（熔点与冰晶生长点之差）与抗冻糖蛋白的分子量的关系，结果与实验数据较好地符合。     

热滞蛋白活性的化学动力学的进一步研究

根据热滞蛋白溶液中抗冻分子与冰晶表面相互作用特点，提出了热滞蛋白在冰晶表面吸附的动力学理论，导出了热滞蛋白活性的表达式．计算了各种热滞蛋白溶液的热滞值，得到了与实验结果符合较好的结论，并讨论了热滞蛋白分子在冰晶表面吸附反应过程中的协同效应     

鱼抗冻蛋白在E.coli和Yeast中高效表达的理论初探

按照Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｙｅａｓｔ甚高表达基因中的同义密码子使用、碱基构成和密码子之间的碱基关联的ＥＥＮＳ模式，对鱼抗冻蛋白基因ＡＦＰＩＩＡ７进行了改造，理论上使得ＡＦＰＩＩＡ７基因在Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｙｅａｓｔ中的表达水平有了非常显著的提高．未改造的ＡＦＰＩＩＡ７基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达，其表达水平为ＣＡＩ＝０．４１１，ＣＥＩ＝３．２４０是较低表达水平的基因，估计值在１０～１０３ｍｏｌ／ｃｅｌｌ之间．经改造后，其表达水平变成甚高表达基因ＣＡＩ＝０．８６８，ＣＥＩ＝５．９７８，估计值在１０４～１０５ｍｏｌ／ｃｅｌｌ之间．在Ｙｅａｓｔ中表达，未改造的ＡＦＰＩＩＡ７基因的表达水平为ＣＡＩ＝０．３５９，ＣＥＩ＝５．８８０，也是较低表达基因．经改造后，此基因为Ｙｅａｓｔ的高表达基囚，ＣＡＩ＝０．７０３，ＣＥＩ＝１１．６６８．本文的方法为异质基因获得高效表达提供了一种理论途径．     

抗冻蛋白-GUS基因诱导性融合表达载体转化烟草植株中GUS活性测定

把修饰合成的带有甘薯信号肽序列的抗冻蛋白成串基因与β-葡萄糖醛酸苷酶(GU S)报道基因融合克隆在大豆热休克启动区下游构建了温度诱导型双元载体pBF 04,三亲株配对法转化根癌农杆菌,叶盘法导入烟草,获得了转基因烟草植株.将10株转基因烟草放置在40℃诱导不同时间,利用荧光光度分析法测定水解液中GU S活性,结果诱导18、24、48小时的4株中GU S活性明显高于对照组和诱导6、12小时组,说明我们修饰合成的抗冻蛋白与GU S基因融合构建的载体在热休克启动区控制下可以诱导表达.经组织化学法测定这些阳性植株的叶片和茎段切片细胞间隙显示GU S活性,提示甘薯信号肽可能起作用.     

极区鱼的抗冷冻机理

鱼抗冷冻蛋白和抗冷冻糖蛋白有抗冻功能，本文阐述并讨论了各种抗冻机理学说。本文在预测了ＡＦＰⅠ、ＡＦＰⅡ和ＡＦＰⅢ的二级结构并分析了ＡＦＰ三级结构的特点基础上，计算了抗冷冻蛋白的热滞，得出了与实验相符结论．