分泌载体pPSA18的构建及地衣杆菌淀粉酶在枯草杆菌中的表达和分泌

本文报道利用枯草杆菌噬菌体Spol 的启动子Spac Ⅰ,合成的解淀粉芽胞杆菌信号序列及枯草杆菌质粒PUB 18重组,构建分泌型表达载体并将地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因(缺失启动子及信号序列)引入构建的载体,获得重组质粒pPSA 18.将此质粒转化枯草杆菌QB1130(amy~-)感受态细胞,在含5μg/ml 卡那霉素及1%可溶性淀粉的LB 平板上筛选Km~r 及淀粉酶阳性的转化子.从阳性转化子中提取质粒,经酶切分析后重新转化枯草杆菌QB1130,得到的转化子全部都能向胞外分泌淀粉酶,证明构建的载体能在枯草杆菌中表达和分泌外源基因产物.     

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

为提高α-淀粉酶的分泌效率,将不同天然信号肽的N,H和C区进行组合,以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分泌的天然信号肽,以其中4种天然信号肽（SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB）的H区替换信号肽SPsacB的H区,构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。结果表明,适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1,且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%,较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍,较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法,可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因工程菌的研究进展

综述了国内外地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因工程菌的研究进展，并就基因工程菌的优缺点进行了简要分析．     

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichenifarmis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株．本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上，通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp，与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中，经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌，再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中，其阳性克隆在37℃1．0mmol/L IPTG诱导下，α-淀粉酶的基因得到了较好的表达．表达产物经SDS—PAGE鉴定，确定表达的蛋白大小为58000 Dal左右，与理论推导的分子量相一致；并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究。     

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α-淀粉酶的纯化及性质

地衣芽孢杆菌A.4041（Bacillus，licheniformisA．4041）耐高温α-淀粉酶，经硫铁沉淀和垂直板制备凝胶电泳纯化，得到三种电泳均一的组分，α－Ⅰ，α－Ⅱ和α－Ⅲ．其相对质量分数分别为14.7％，32.2％和52.9％；等电点为5．2，5．4和5．5；相对分子质量为48000，55000和60000．酶作用于可溶性淀粉的米氏常数分别为4.5mg／mL，3．4mg／mL和2．6mg／mL．最适作用温度皆为90℃；最适pH为6.0～6.5；稳定pH范围皆为4～11．5在温度高于70℃，保温30min条件下，三组分的活力开始下降，但α－Ⅱ和α－Ⅲ在100℃，保温30min时仍分别保持15％和20％的残余活力，表明该酶的热稳定性良好．Ca2+，Mg2+，K+对酶明显激活；Cu2+，Fe3+，Zn2+，Al3+，EDTA、甲醛、戊二醛对酶强烈抑制．     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

地衣芽孢杆菌1.934培养条件的优化

研究了生物肥功能菌——地衣芽胞杆菌1.934 (Bacillus licheniformis)培养条件对菌体生长量的影响.采用了单因素实验和响应曲面法(RSM)设计实验和分析数据.获得了菌体摇瓶培养的最适条件:培养温度35℃,转速为150r/min,接种量为3.6％,pH为7.5.地衣芽孢杆菌在最适条件下培养约20h,淀粉酶的酶活最高,活力可达12.7U/mL培养液.培养约27h得到最大的菌体收益.     

地衣芽孢杆菌基因文库的构建及分析

作为一种高效无毒、无二次污染以及能够生物降解的水处理剂,生物絮凝剂受到越来越多的关注.以一株具有强絮凝活性地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为实验菌,通过构建基因组文库,尝试筛选絮凝基因阳性克隆子.结果表明,该菌株基因文库构建成功,共得到2.1×103克隆子.随机挑取17个阳性克隆子进行DNA测序分析,发现一些相对保守蛋白及2个不具有明确功能的基因.该结果为进一步研究地衣芽孢杆菌全基因组结构功能及细菌絮凝基因奠定了基础.     

耐碱性芽孢杆菌碱性淀粉酶研究Ⅰ──菌种的分离与筛选

从１５份土样中筛选出一株产碱性淀粉酶的耐碱性芽孢杆菌９－Ａ２，经菌学鉴定为耐碱性巨大芽孢杆菌。９－Ａ２菌株可在ｐＨ１０以上的环境中生长，在ｐＨ９～１０条件下产生较高的碱性淀粉酶。碱性淀粉酶在ｐＨ６～１１范围内比较稳定，酶反应的最适ｐＨ为９，最适温度为５０℃     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

枯草芽孢杆菌工程茵产耐酸性高温a-淀粉酶发酵条件的优化

利用基因工程手段获得的产耐酸性高温弘淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB—amyd／WB600,通过单因素筛选及正交实验进行发酵培养基优化,得到的最佳配方为（g／L）：玉米粉20,蛋白胨30,CaC120．5,Na2HP048．同时对实验室摇瓶条件下液体发酵的主要影响因素初始pH、接种量、装液量、转速、温度等进行探讨,确定了最佳培养条件：37℃、pH6．5、200r／min摇床培养36h,接种量为2％,装液量为30mL／250mL．在此优化条件下,耐酸性高温弘淀粉酶活力达到3980U／mL,是未优化条件下的2．1倍．     

枯草芽孢杆菌粉剂作为鸡饲料添加剂的研究

利用具有卡那霉素抗性和能分泌α－淀粉酶的生物工程菌枯草芽孢杆菌Ｂｓ９６４作为微生物饲料添加粉剂，饲喂不同发育时期的鸡，分别测其平均日增质量．根据实验结果，证实枯草芽孢杆菌Ｂｓ９６４对鸡的生长有促进作用，分析了不同时期饲喂枯草芽孢杆菌Ｂｓ９６４对鸡生长的影响．     

多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达及发酵条件优化

构建多功能淀粉酶OPMA-N和OPMA-G的分泌表达载体pMA5-OPMA-N和pMA5-OPMA-G, 应用枯草杆菌表达系统实现了多功能淀粉酶
OPMA-N与OPMA-G的表达与分泌, 并分别对其发酵工艺进行优化. 实验结果表明: OPMA-N适宜的表达与分泌条件为： 质量分数为1%的MgSO₄、 质量分数为0.3%的尿素和质量分数为0.5%的酵母粉为培养液, pH=6.5, 培养液装液量为16%, 37 ℃发酵培养48 h; OPMA-G的最适分泌表达条件为： 质量分数为1%的NaCl、 质量分数为1%的淀粉和质量分数为0.8%的酵母提取物为培养液, pH=7.0, 培养液装液量为32%, 37 ℃发酵培养36 h; 在上述条件下, OPMA-N和OPMA-G的分泌水平分别为发酵液中总蛋白的45%和58%, 分泌酶的比活力分别为每毫克4.57和4.65酶活力单位.     

枯草芽孢杆菌质粒pGB38复制子的分离及其稳定…

质粒ｐＧＢ３８是从中国戈壁滩沙土的枯草芽孢杆菌中分离得到的天然质粒。该质粒基因组总长为５．８ｋｂ，相对于细胞染色体的考贝数是４个，最小复制子们于１．５ｋｂ的ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ片段，在没有任何选择压的条件下能够稳定持久地存在于细胞内，显然有着优良的质粒特性，利用质粒ｐＧＢ３８的复制子构建了穿梭质粒ｐＧＢ２０和ｐＧＢ１５，重组穿梭质粒的分离稳定性好，可以作为理想的枯草芽杆菌的基因工程载体。     

茅台酒曲中产淀粉酶细菌分离及性质

从茅台酒曲中分离出产α淀粉酶优良菌株,经鉴定为芽孢杆菌属。在这些菌株中,所产α-淀粉酶以中温型为主,最适宜温度在50~60℃之间,也分离到一株最适宜温度为80℃高温型酶的菌株。同时研究了发酵培养基中碳氮源比对一株芽孢杆菌酶活力的影响及酶活力与培养时间的关系,结果表明,当碳氮比为9∶4 5时酶活力较高,酶活力在生长周期稳定期后期到死亡期达到最高。