SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析

通过RT-PCR获得SARS冠状病毒N蛋白基因，分别克隆到原核表达载体pET21a，pET32a和pGEX-4T-1中，将3种重组质粒pET2la-N，pET32a-N和pGEX-4T-1-N分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，细菌中分别表达出约46kD的重组N蛋白、约60kD的6xHis-N融合蛋白和约70kD的GST-N融合蛋白，表达量分别达总蛋白的45％、40％和30％．进一步的分析表明：6xHis-N融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达，该可溶性组分占细菌裂解液的70％左右，且能被6xHis抗体所识别．用蛋白分析软件对N蛋白进行了序列分析和二级结构预测．SARS冠状病毒N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，有助于进一步结晶后进行X射线晶体衍射分析其结构与功能．     

重组SARS冠状病毒S蛋白的原核表达研究

目的克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白)。方法合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过W estern印迹对重组蛋白质进行鉴定。结果重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的多克隆抗体。结论经E lisa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制。     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的为SARS感染后建立一种特异性免疫学诊断方法,为基因疫苗的研制提供备选实验材料.方法利用基因重组的方法,在大肠杆菌中表达了SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白全长基因,经包涵体的初步纯化,金属螯合层析进一步纯化N蛋白,SDS-PAGE电泳和ELISA方法进行结果检测.结果N蛋白抗原与30名SARS感染患者血清结合全部为阳性,对照组30名正常人血清为阴性,30名发热但非SARS患者血清为阴性.结论利用基因重组的方法对SARS-CoV N蛋白进行了表达和纯化,证明该重组N蛋白抗原具有良好的反应特异性,是良好的应用于病毒感染早期诊断的抗原.完全可用于组构检测核心抗体的诊断试剂.并建立了免疫学的检测方法,为抗体检测提供了安全、方便的手段,并为基因工程疫苗研究奠定了基础.     

SARS-CoV棘突蛋白片段在E.coli中的表达及免疫活性分析

SARS-冠状病毒(SARS-CoV)棘突蛋白(Spike,S)是构成病毒包膜突起的主要成分,属于型膜糖蛋白,全长1255aa,在病毒入侵宿主细胞中起重要作用.本文利用生物信息学技术,界定冠状病毒SARS-CoVS蛋白的抗原决定区域,通过PCR扩增相应片段,克隆至原核表达载体pET-H,得到四个重组质粒pET-HS1、pET-HS3、pET-HS4、pET-HS5.经序列测定证实后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导获得表达,产物经紫外薄层扫描显示目的蛋白占菌体细胞总蛋白量的20%~30%.经Westernblot检测,表达蛋白与恢复期SARS病人血清呈高反应原性.纯化相应蛋白免疫小鼠,所获抗血清效价达1∶3×103.与SARS诊断试剂反应呈阳性,这一工作将为进一步研究S蛋白的定位、功能及SARS诊断提供帮助.     

可逆光致变色的藻红蓝蛋白α亚基分子设计

从层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基基因表达质粒pGEMD-pecA出发，通过酶切、削平或补充补末端及重新环合等技术，使其后的阅读框发生移码突变，从而到C－端缺失24个和36个氨基酸的两个缺失突变体pGEMD-pecA-C24和pGEMD-pecA-C36，用PCR技术将已突变的基因片段转入表达载体pET30中，得到pET30-pecA-C24和pET30-pecA－C36，获得高效表达，利用PCR技术从pGEMD-pecA中扩增出N－端缺失20个和32个氨基酸pecA的突变基因片段，并克隆于表达载体pET30中,得到pET30-pecA-N20和pET30-pecA-N32，获得高效表达，两个C－端缺的突变的脱辅基蛋白无论有或无藻红蓝蛋白连接／异构酶催化，均不能与藻蓝胆素共价偶联，两个N－端缺失突变脱辅基蛋白均能在藻红蓝蛋白连接／异构酶催化下与藻蓝胆系共价偶联，且色素从藻蓝胆素转化为藻紫胆素。     

油菜MKK2基因原核表达及特性分析

MAP激酶级联途径在信号传导过程中发挥着重要作用.以白菜型冬油菜"陇油6号"为材料,利用RT-PCR法克隆到全长MKK2基因cDNA,生物信息学分析表明油菜MKK2蛋白为亲水蛋白,包含有MAPKK蛋白所特有的磷酸化基序S/T-X_(3-5)-S/T.将其与大肠杆菌表达载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-MKK2,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blotting检测结果表明该基因表达了1个约43 kD的蛋白.实时荧光定量PCR结果显示该基因表达没有组织特异性,其转录受UV-B胁迫的诱导.     

Lp-1643蛋白单一结构域的黏附功能研究

从植物乳杆菌KLDS 1.0320中克隆出Lp-1643蛋白N端的第一个结构域基因,与表达载体pET30a连接后成功构建重组质粒pET30a/N1。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,以IPTG进行诱导,重组蛋白以可溶形式成功获得表达。通过亲和色谱技术用HisTrap FF柱对重组蛋白进行了分离纯化。以BSA作为对照,研究了重组蛋白His-N1对KLDS 1.0320菌株黏附Caco-2细胞的影响,发现用该重组蛋白预处理Caco-2细胞之后,其上黏附的KLDS 1.0320数量显著减少（P<0.05）。这说明Lp-1643蛋白N端的第一个结构域具有黏附Caco-2细胞的功能。     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

人新基因HCL cDNA的克隆与原核表达

根据与人宿主细胞因子C1基因有一定同源性的人EST AA488367,在GenBank中查出它的UniGene Hs.20597,根据此UniGene设计引物,在人胎脑cDNA文库中筛出一长度为1 680 bp cDNA.将它命名为HCL,HCL的开放阅读框编码406个氨基酸,与人宿主细胞因子C1、酵母tealp有一定的同源性,第280～329氨基酸为kelch结构域,推测HCL蛋白与细胞周期可能有关.HCL的GemBank登录号为AF113131.将HCL的全编码区克隆进pET30a后,HCL蛋白在大肠杆菌中高效表达.     

传染性非典型肺炎病毒核蛋白的表达与活性检测

用PCR方法，人工合成传染性非典型肺炎病毒(SARS-CoV)核蛋白(N)全编码基因，并构建原核表达载体．在大肠杆菌中进行表达．结果重组N蛋白表达产量占菌体总蛋白的40％以上，主要以可溶形式存在．用SARS患者急性期血清进行蛋白印迹检测，表明可溶形式和包含体形式均有明显活性．包含体形式的重组蛋白经纯化后纯度可达90％以上，活性与纯化前相当，可作为SARS抗体诊断试剂盒的抗原原料．     

Neurospora NADP-glutamate dehydrogenases and its expression in E. coli and transgenic plants

Genes of NADP-glutamate dehydrogenase (NADP-GDH) were cloned from Neurospora intermedia (Ni), N. crassa (Nc), and N. sitophila (Ns). The sequences showed a high degree of homology at the cDNA and protein level. The three GDH genes were cloned into pET30a and expressed in E. coli. The activity assay of purified GDH showed that the Ni-GDH had a higher activity and affinity to ammonia than Ns-GDH, and Nc-GDH. The K_m value of Ni-GDH ranges from 0.3 to 0.45 mmol/L. Ni-gdh gene was transformed to Nicotiana bethamiana plants. The transformed plants grew much better in low nitrogen media than the only ROKII vector transformed control.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

兔生长激素cDNA克隆和表达

从兔脑下垂体中的mRNA中,利用合成引物逆转录PCR,获得了前体和成熟生长激素的cDNA,成熟生长激素的cDNA克隆在pET-3a表达载体并转化到大肠杆菌BL21(DE3 plys)中,获得了高效表达,表达量达到大肠杆菌总蛋白的40%。     

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).     

SARS冠状病毒核蛋白的质谱鉴定

利用质谱技术,对纯化的SARS冠状病毒的核蛋白进行初步鉴定与分析.所获得的质谱分析数据中,分子量为2881.19Da的酶切肽段的氨基酸序列与其它冠状病毒的同源性比较分析表明,SARS冠状病毒和其它冠状病毒均含有一个高度保守的基序“FYYLGTGP”.     

SARS冠状病毒及相关病毒的分子系统学分析

根据SARS冠状病毒及其相关病毒的基因组核酸序列和3种不同蛋白质序列，应用最大简约法和最小进化法重建系统发育树；并对SARS冠状病毒的11个推测蛋白质(ORF)做BLAST分析。结果表明，SARS冠状病毒和鼠肝炎病毒——牛冠状病毒分支构成姊妹群。其单系群性质得到强有力的统计学支持。这暗示了SARS的爆发可能源自种间屏障的突破事件，该病毒天然宿主可能为猪、牛或鼠。SARS冠状病毒与已知的人冠状病毒分属冠状病毒科的不同分支，因此致病机制可能有很大不同。3个基因的系统树分支格局的一致性表明：SARS冠状病毒这3个主要基因与其他冠状病毒间不存在重组，但全部11个ORF的BLAST分析却认为其基因组上一些小的区段可能与其他病毒存在重组。