5‘端序列对hGM—CSF在大肠杆菌中表达水平的影响

设计交购构建了三种起始密码子ＡＴＧ上下游不同序列的人ＧＭ－ＣＳＦ原核表达质粒，对其核苷酸序列进行了分析验证后、使它们分别在大肠杆菌中表达了人ＧＭ－ＣＳＦ。结果表明，：ｐＬＧＭ３对ＧＭ－ＣＳＦ的表达量比ｐＬＧＭ１高的６倍，比ｐＬＧＭ伉约３倍。     

血清浓度对SMMC—7721细胞DNA合成的影响

以人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞为材料研究了不同血清浓度对ＤＮＡ合成和细胞生长状态的影响，结果表明几乎在所有处理中短时无血清培养都能刺激ＳＭＭＣ－７７２１细胞的ＤＮＡ合成，且＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量与培养液中ＦＣＳ浓度成明显负相关，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量比值最高可达３９．３２倍．１８ｈ内，随培养时间的增加无血清培养对细胞ＤＮＡ合成的刺激作用逐渐下降，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入量比值从３９．３２倍下降为３．５３倍，     

MTT比色法在检测重组人GM—CSF生物活性中的应用

探索了ＭＴＴ比色法的一系列实验条件，并利用ＧＭ－ＣＳＦ依赖细胞株ＴＦ－１，测定了家蚕基因工程生产的重组人ＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）的生物活性，并与半固体培养集落刺激法进行了比较。     

EXPRESSION OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR α IN ANABAENA SP.PCC7120

通过三亲结合转移方式，将含人肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ＿α）ｃＤＮＡ和ｐｓｂＡ启动子的鱼腥藻－大肠杆菌穿梭质粒ＰＤＣ＿ＴＮＦ导入单细胞丝状鱼腥藻７１２０中．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，人肿瘤坏死因子αｃＤＮＡ在鱼腥藻７１２０细胞中能以自主复制形式存在于ＰＤＣ＿ＴＮＦ质粒上．ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ和免疫印迹分析结果显示，转ＰＤＣ＿ＴＮＦ的鱼腥藻７１２０可表达分子量约为１７ｋｕ的人ＴＮＦ＿α，其表达量约占藻体蛋白的１６％左右．转ＰＤＣ＿ＴＮＦ的鱼腥藻７１２０粗提液的ＴＮＦ生物学比活性约为２５×１０４ｕ／ｍｇ．     

微波和长春新碱对白血病细胞的体外净化研究

旨在研究一种较好的微波和长春新碱的联合方法,用于白血病细胞的体外净化．将微波和长春新碱分别单独以及联合作用于正常骨髓细胞ＨＬ６０、Ｕ９３７和Ｋ５６２细胞株,通过ＧＭ－ＣＦＵ和ｔＣＦＵ的测定来评价体外净化的效果．结果发现微波和长春新碱对ＧＭ－ＣＦＵ、ｔＣＦＵ存活率均表现出抑制作用,抑制程度呈现出功率相关性和浓度相关性;在一定范围内,微波和长春新碱对３种细胞株ｔＣＦＵ存活率的抑制显著大于ＧＭ－ＣＦＵ（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）;微波和长春新碱联合作用对３种细胞株的杀伤作用比单用长春新碱有显著性增加（Ｐ＜０．０５）,而不显著增加对ＧＭ－ＣＦＵ的抑制（Ｐ＞０．０５）．这一结果提示微波和长春新碱联合用于白血病细胞的体外净化能产生协同效应,值得进一步研究．     

rhGM-CSF/IL-3融合蛋白中残余菌体DNA的检测

本文利用地高辛标记及检测试剂盒,标记ｐｏｐ２１３６（ＰＭＴＧ３）工程菌染色体ＤＮＡ作为探针,检测基因工程药品重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素－３（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白中残余的菌体ＤＮＡ．结果符合质量标准每剂＜１００ｐｇ．     

多重网格方法在通风空调气流数值模拟中的应用

多重网格方法（ＭＧＭ）具有较快的收敛速度．本文讨论了全近似完全的多重网格方法（ＦＡＳ－ＦＭＧ）在三维室内气流数值模拟中的应用．通过对计算实例的结果分析,表明它的收敛速度比单层网格迭代法提高了３～４倍,并明显地改善了收敛过程的稳定性．     

人抑癌基因nm23—H1在逆转录病毒载体上表达的研究

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。     

启动子对外源基因在转基因植物中表达的影响

将来自ｐＢＩ１２１质粒的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子片段插入到ｐＢＩ１２１的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与ＧＵＳ基因之间，构建了串联的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子载体ｐＬＢ３８．通过三亲交配，将ｐＢＩ１２１及ｐＬＢ３８分别转移到含ｐＧｖ３８５０的农杆菌中，成为适合本研究的双元载体。以叶圆盘转化法将外源基因转入烟草，获得了２种转基因植株。经ＤＮＡ分子杂交、ＮＰＴⅡ点分析、ＧＵＳ荧光定性及定量分析，证明外源基因已整合进烟草基因组并获得表达。ｐＬＢ３８的ＧＵＳ表达量为ｎＢｌ１２１的３～４倍，这表明启动子数目的不同会直接影响其启动基因的表达水平。     

血清浓度对SMMC－7721细胞DNA合成的影响

以人肝癌ＳＭＭＣ—７７２１细胞为材料研究了不同血清浓度对ＤＮＡ合成和细胞生长状态的影响，结果表明几乎在所有处理中短时无血清培养都能刺激ＳＭＭＣ—７７２１细胞的ＤＮＡ合成，且３Ｈ—ＴｄＲ掺入量与培养液中ＦＣＳ浓度成明显负相关，３Ｈ—ＴｄＲ掺入量比值最高可达３９．３２倍．１８ｈ内，随培养时间的增加无血清培养对细胞ＤＮＡ合成的刺激作用逐渐下降，３Ｈ—ＴｄＲ掺入量比值从３９．３２倍下降为３．５３倍，结果提示人肝癌ＳＭＭＣ—７７２１细胞对培养液中短时无血清的反应不同于其它细胞株     

宣威火腿中抗菌肽的分离、纯化及鉴定

为探究干腌火腿中生物活性多肽的抗菌活性及其组成,选取产自中国云南省曲靖地区的宣威火腿为材料,通过缓冲液浸提的方法提取火腿中的多肽成分。以粗提多肽对单增李斯特菌和O157型大肠杆菌的生长抑制情况为指标进行抗菌性评价,同时结合离子交换色谱、尺寸排阻色谱等技术对宣威火腿粗多肽进行分离与纯化,并选取其中抑菌活性较强的组分进行氨基酸序列测定。抑菌实验发现宣威火腿粗多肽具有显著抑制单增李斯特菌和O157型大肠杆菌生长的效果；经过逐级分离纯化得到的各组分具有不同的抑菌活性。其中组分7活性最强,对大肠杆菌和李斯特菌的抑菌率分别为98%和56%。通过Nano-LC-ESI-MS/MS肽序列鉴定,最终得到抑菌活性较强的多肽序列,分别为QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANIAVDK。将鉴定得到的3条多肽化学合成后进行抑菌实验发现,合成多肽均具有较好的抑菌效果,对O157型大肠杆菌的生长抑制效果均显著高于单增李斯特菌。研究结果表明宣威火腿中含有抑菌效果的肽类成分,从而为阐释宣威火腿多肽的功能特征提供理论依据。     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体:M1(H20L)、M2(K60E)、M3(K94E),并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达.酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1.10、1.22和1.37倍,且比活力都有不同程度提高.与含野生型pyrBI基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15,mmol/L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5.4、6.0和8.5倍.最后将各突变质粒转入到E.coli Cyt10(Δcdd)中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化.     

模式生物的外显子、内含子和基因间序列的识别

基于核酸序列在剪切位点上保守性、组分的不同和编码序列阅读框架的3周期性,模式生物全基因组序列分为外显子、内含子和基因间序列三类.三个标准离散源分别由64个三联体在整条序列上的概率和4个碱基序列首尾(剪切位点附近)共30个位点上的概率共同构成.某条序列的类型就由该序列的离散量同相应区间上三个标准离散量的离散增量确定.结果表明:具有184个信号参数的离散量预测比只有64个三联体参数的结果要高出5%,总体预测成功率:线虫为87.37%,拟南芥为91.08%,果蝇为92.28%,原核生物大肠杆菌的二种序列预测率为92.88%,酵母菌为94.88%.     

沙门氏菌rDNA ISR序列测定及特征分析

以细菌ｒＤＮＡＩＳＲ通用经物对鼠伤寒等８种沙门氏菌进行了ＰＣＲ分析，表明在沙门氏菌属的不同菌株中都存在１个比大肠杆菌的Ｌ－ＩＳＲ长几十年碱基对的Ｌ－ＩＳＲ。进一步测定和分析鼠伤寒，纽波特和田纳西３种沙门氏菌Ｌ－ＩＳＲ的全序列，揭示出不同血清型的沙门氏菌具有相似的ｔＲＮＡ基因的间隔区和特征性核苷酸序列。这些特征序列可以作为沙门氏各的分子标志，用于沙门氏菌的分子检验和系统学鉴定。     

tRNA丰度是影响蛋白质二级结构形成的一个因素

从人和大肠杆菌蛋白质和DNA序列的统计分析，发现mRNA的对应一定蛋白质二级结构的m密码子片段(m=3，4，…，8)，当平均tRNA拷贝数高时(对于人高于11，对于大肠杆菌高于2．O)，偏好编码螺旋，而避免编码线团；当平均tRNA拷贝数低时，偏好性正好反过来．对于beta折叠，未发现和tRNA拷贝数有明显的统计关联．对大肠杆菌也研究了密码子频数与蛋白质二级结构的相关性，其间的关联比tRNA拷贝数与蛋白质二级结构的关联弱．因此，tRNA拷贝数与蛋白质二级结构的关联可能更为本质．机制目前尚不清楚．一种可能的解释是：tRNA丰度以某种方式影响了新生肽链的折叠，通过翻译精度的因素影响了蛋白质二级结构的形成．     

Cloning and Characterization of Gene Promoters from Bacillus pumilus

DNA fragments obtained from Sau3AI partially digested total DNA of Bacillus pumilus UN31-C-42 are first inserted into BamHI site of pSUPV4, a promoter-probe vector. The recombinant DNA molecules are transformed into Escherichia coli cells and eight-three Kanr clones (named pSUBp1-pSUBp83) are obtained. The inserted fragments in pSUBp53, pSUBp57, pSUBp21, which showed high level of kanamycin- resistance, are sequenced and analyzed, respectively. These fragments contain some con-served sequences of prokaryotic gene promoters, such as TATAAT and TIGACA box. The promoter frag-ment Bp53 could efficiently promote the alkaline protease gene of B. pumilus expression not only in E.coli but also in B. subtilis cells.     

Effects of interlinker sequences on the biological properties of bispecific single-chain antibodies

Single-chain bispecific antibody (scBsAb) is one of the promising genetic engineering antibody formats for clinical application. But the effects of interlinker sequenees on the biological properties of bispecific single-chain antibodies have not been studied in detail. Three interlinker sequences were designed and synthesized, and denominatedas Fc, HSA, 205C‘, respectively. Universal vectors with these different interlinker sequences for scBsAb expression in E.coli were constructed. A model scBsAb based on a reshaped single-chain antibody (scFv) against human CD3 and a scFv directed against human ovarian carcinoma were generated and expressed in E. coli. The results of SDS-PAGE and Western blot showed that the different interlinker sequences did not affect the expression level of scBsAb. However, as demonstrated by ELISA and pharmacokinetics studies performed in mice, scBsAbs with different interlinker sequenees had difference in the antigen-binding activities and terminal haw-life time (T1/2β) in vivo, the interlinker HSA could remarkably prolong the retention time of scBsAb in blood. These results indicated that the peptide sequence of intertinker could affect important biological properties of scBsAb, such as antigen-binding properties and stability in vivo. So, selection of an appropriate interlinker sequence is very important for scBsAb construction. Optimal interlinker can bring scBsAb biological properties more suitable for clinical application.     

突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM-CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM-CSF，具有毒副作用小等优点，鉴于非糖基化的hGM-CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM－CSF活性更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM-CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现该突主型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM-CSF的活性。     

模式生物基因序列的识别

真核生物的全基因组序列可分为三种:外显子、内含子和基因间序列.基于剪切位点附近序列的保守性,序列的组分特征和编码序列阅读框存在三周期性,三种序列的标准离散源由序列上64个三联体的概率和5′端与3′尾剪切位点附近(共30位点)上4个碱基的概率,共184个参数构成.某条序列的类型就可以由该序列的离散量与上面三个标准离散源的离散量之间的离散增量最小值决定.当标准离散源具有184个信息参数时预测率比64参数预测的成功率至少提高4.61%,前者的预测成功率依次如下:线虫88.37%,酵母菌90.72%,拟南芥91.08%,果蝇92.28%,大肠杆菌92.88%.对预测成功的和错误的两类序列进行比较,发现这些预测错误序列的184个参数值与其预测结果所属的那类序列本身的参数值十分类似.