低氧预适应对小鼠海马神经保护作用机制研究——基于TSC1/mTOR/自噬信号通路

 为研究低氧预适应（HPC）对小鼠海马神经保护作用的机制，采用Western Blot方法检测对照组、低氧组、低氧预适应组3组实验小鼠的TSC1、mTOR和磷酸化mTOR及LC3蛋白的表达，验证TSC1/mTOR/自噬通路是否参与HPC对小鼠海马的神经保护作用。通过体外HT22细胞转染TSC1-peGFP，给予低氧刺激后，采用MTS法检测细胞活性，进一步确定TSC1在低氧条件下的神经保护作用。结果显示，HPC可增加小鼠低氧耐受时间；与对照组相比，HPC组TSC1蛋白表达升高，磷酸化mTOR蛋白表达下降；体外转染eGFP-TSC1质粒组与空载组相比，细胞活性增强。结果表明HPC可能通过上调TSC1表达，下调mTOR磷酸化水平激活自噬对小鼠海马发挥神经保护作用。     

不同温度热处理对大鼠骨骼肌Akt/mTOR信号通路的影响

热处理会诱导应急蛋白,从而促进细胞蛋白质合成并进一步导致肌肉肥大.但热处理对细胞内蛋白质合成中主要信号通路Akt/mTOR信号途径的影响鲜有报道.本研究分析了热处理对大鼠骨骼肌中Akt/mTOR信号途径的作用.利用Western blot技术检测了不同温度(37℃、38℃、39℃、40℃)的热处理对大鼠腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明39℃、40℃的热处理能够激活Akt及下游p70S6K的活性而对于热激蛋白HSP72的表达水平没有影响.     

油菜素甾醇信号通路中BKI1互作蛋白ERD7的筛选与鉴定

油菜素甾醇(Brassinosteroid,BR)是一类重要的调控植物生长发育的激素,BKI1在BR信号转导通路中具有正负调控的双重功能.为了深入研究BK11正/负调控BR信号通路的分子机制,本研究使用BKI1作为诱饵蛋白对拟南芥cDNA文库进行酵母双杂交筛选,获得了一段新的与BR信号通路组分BKI1相互作用的肽段,BLAST搜索显示该肽段与拟南芥ERD7的N端序列一致.生物信息学分析表明ERD7是一个植物特异表达基因,在单子叶、双子叶、以及低等植物中保持很高的一致性.酵母双杂交方法证实全长ERD7与BKI1能够相互作用,Pull-down分析证实这两个基因在植物体内直接相互作用,烟草细胞瞬时表达显示ERD7和BKI1能够共定位于细胞质和细胞膜.BKI1和ERD7相互作用的发现为进一步研究BKI1的调控机制奠定了基础.     

G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控

POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.     

mTOR复合物在细胞迁移中的作用

细胞迁移是一个高度有序且多信号通路协调控制的过程,在个体发育、器官形成、伤口愈合及肿瘤恶性转移过程中具有重要作用.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)广泛存在于从酵母到哺乳动物的细胞中,参与调控与细胞生长和代谢密切相关的多种生命过程,其参与形成的复合物在调控细胞迁移过程中发挥重要作用.对雷帕霉素靶蛋白复合物的组成和它们在细胞迁移中的作用的最新研究进行系统阐述.     

ERK信号通路调控Spink3在肝癌中的表达

目的探究Spink3在小鼠肝癌组织中的表达调控机制。方法采用RT-qPCR方法检测SPINK1在人肝癌及Spink3在H-ras12V转基因肝癌中的mRNA表达水平。采用Western blot和RT-q PCR法检测原代培养小鼠肝癌组织和肝癌旁组织中的ERK和mTOR信号通路的变化及Spink3的mRNA表达水平。体内抑制ERK和mTOR信号分子活性,检测其对Spink3 mRNA表达水平的影响。结果与肝癌旁组织相比,SPINK1和Spink3的mRNA水平分别在人肝癌组织和小鼠肝癌组织中显著升高(P0.05)。在原代培养的小鼠肝癌和肝癌旁组织中,与0 h相比,随着体外培养时间的延长(6、12、24、48 h),p-ERK和p-mTOR信号分子水平明显下降;与此相一致,Spink3的mRNA的表达水平也显著降低(P0.01)。体内抑制ERK信号分子的活性,显著下调了Spink3的mRNA表达水平(P0.05)。但体内抑制mTOR信号分子的活性,对Spink3的mRNA表达没有显著影响。结论 SPINK1/Spink3在肝癌组织中过表达,有望成为肝癌的临床诊断指标。ERK通路可能是上调Spink3表达的主要信号通路。     

Ras /MAPK / ERK 通过协同 NF- KB 促进肝癌细胞中 cyclinD1 的表达

摘要: 目的 探讨 Ras 癌基因在体内诱导肝肿瘤发生过程中促进 cyclin D1 表达的分子机制。方法 利用 H-ras12V 转基因雄鼠肝肿瘤组织、肿瘤周围组织以及非转基因雄鼠肝组织进行病理分析和总 RNA 及蛋白质的提取。应用 qRT-PCR 和 Western blot 方法检测 cyclin D1 的表达以及调控 cyclin D1 表达的相关信号通路激活状态。采用 miRNA 测序、生物信息学分析和 qRT-PCR 验证方法检测 miR-5102 基因的表达水平。结果 与非转基因雄鼠肝组 织和肿瘤周围组织相比,肿瘤组织中 cyclin D1 基因的 mRNA 和蛋白表达水平显著升高。与非转基因雄鼠肝组织 和肿瘤周围组织相比,在肿瘤组织中 MAPK 信号转导通路中的 ERK 信号分子的蛋白表达水平和磷酸化水平都显 著升高,在肿瘤组织中成高激活状态,NF-KB 信号通路中的抑制因子 IKB 蛋白水平显著降低。miR-5102 的表达水 平没有显著变化。结论 在 Ras 癌基因诱导的肝肿瘤发生过程中,主要通过激活 MAPK/ERK 和 NF-KB 信号通路促进 cyclin D1 的表达。     

Ras/MAPK/ERK通过协同NF-κB促进肝癌细胞中cyclinD1的表达

目的探讨Ras癌基因在体内诱导肝肿瘤发生过程中促进cyclin D1表达的分子机制。方法利用H-ras12V转基因雄鼠肝肿瘤组织、肿瘤周围组织以及非转基因雄鼠肝组织进行病理分析和总RNA及蛋白质的提取。应用qRT-PCR和Western blot方法检测cyclin D1的表达以及调控cyclin D1表达的相关信号通路激活状态。采用miRNA测序、生物信息学分析和qRT-PCR验证方法检测miR-5102基因的表达水平。结果与非转基因雄鼠肝组织和肿瘤周围组织相比,肿瘤组织中cyclin D1基因的mRNA和蛋白表达水平显著升高。与非转基因雄鼠肝组织和肿瘤周围组织相比,在肿瘤组织中MAPK信号转导通路中的ERK信号分子的蛋白表达水平和磷酸化水平都显著升高,在肿瘤组织中成高激活状态,NF-κB信号通路中的抑制因子IκB蛋白水平显著降低。miR-5102的表达水平没有显著变化。结论在Ras癌基因诱导的肝肿瘤发生过程中,主要通过激活MAPK/ERK和NF-κB信号通路促进cyclin D1的表达。     

GSK3β调节奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成

GSK3β为AKT1下游信号分子,受PI3K/AKT调控。GSK3β磷酸化后被抑制,通过调节下游分子elF2B等促进乳蛋白合成。mTOR在调节乳蛋白合成中发挥重要作用,近来发现GSK3β和mTORC1均可通过调节SREBP1促进乳脂合成。但尚不清楚GSK3β和mTORC1在调节乳蛋白和乳脂合成方面的相互作用关系。该研究通过对GSK3β进行超表达和抑制,观察其对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞细胞增殖、乳蛋白和乳脂肪合成的影响,及对mTOR途径的影响。结果发现GSK3β是奶牛乳腺上皮细胞细胞增殖、乳蛋白和乳脂肪合成的负调控分子,通过抑制mTORC1发挥作用。蛋氨酸可以抑制GSK3β和激活mTORC1,促进细胞增殖、乳蛋白和乳脂肪合成。该研究结果进一步揭示了GSK3β在奶牛乳腺上皮细胞细胞增殖、乳蛋白和乳脂肪合成中的负调控分子机理。     

筛选与拟南芥绒毡层发育过程中重要的转录因子DYT1相互作用的调控蛋白因子

DYT1是拟南芥绒毡层发育过程中重要的转录因子.DYT1的缺失会导致绒毡层相关功能的缺陷.然而,DYT1并不是使绒毡层功能化的充分因素,暗示了DYT1蛋白需要和其他转录因子形成复合物才能发挥功能.利用酵母双杂交技术以DYT1蛋白为诱饵在拟南芥cDNA文库中筛选与DYT1相互作用的蛋白.通过筛选从文库中得到20个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到8个候选基因序列,从中鉴定出6种候选基因编码可能的转录因子或者其他调控转录的蛋白因子.其中5个编码调控因子的基因都被证实在花药中表达.更进一步,发现另一个对花药发育所必需的转录因子AMS能与DYT1在酵母体内形成转录复合物.表明这2个蛋白可能形成异源复合物在花药中共同调节下游基因的表达.     

HeLa细胞中激酶NUAK1调控Tuberiun的磷酸化

NUAK1是LKB1的下游激酶之一,可被LKB1磷酸化而激活,但对其在LKB1相关信号通路中的功能仍缺乏了解.本研究发现在HeLa细胞中重建LKB1表达后NUAK1与tuberin蛋白免疫共沉淀,提示在野生型LKB1存在时NUAK1与tuberin可能存在直接相互作用.进一步的激酶活性测定和in vivo蛋白磷酸化实验表明:在HeLa细胞中葡萄糖匾乏条件下,野生型LKB1可显著激活NUAK1的激酶活性;而被激活的NUAK1可明显提高tuberin 的磷酸化水平,使用NUAK1 siRNA pool干扰NUAK1的表达则几乎将tuberin的磷酸化水平降低为零.上述结果表明NUAK1可能介导了LKB1对tuberin磷酸化的调节,进而下调mTOR通路,抑制蛋白质合成与细胞生长增殖.     

Drosophila TCTP is essential for growth and proliferation through regulation of dRheb GTPase

Cellular growth and proliferation are coordinated during organogenesis. Misregulation of these processes leads to pathological conditions such as cancer. Tuberous sclerosis (TSC) is a benign tumour syndrome caused by mutations in either TSC1 or TSC2 tumour suppressor genes. Studies in Drosophila and other organisms have identified TSC signalling as a conserved pathway for growth control. Activation of the TSC pathway is mediated by Rheb (Ras homologue enriched in brain), a Ras superfamily GTPase. Rheb is a direct target of TSC2 and is negatively regulated by its GTPase-activating protein activity. However, molecules required for positive regulation of Rheb have not been identified. Here we show that a conserved protein, translationally controlled tumour protein (TCTP), is an essential new component of the TSC-Rheb pathway. Reducing Drosophila TCTP (dTCTP) levels reduces cell size, cell number and organ size, which mimics Drosophila Rheb (dRheb) mutant phenotypes. dTCTP is genetically epistatic to Tsc1 and dRheb, but acts upstream of dS6k, a downstream target of dRheb. dTCTP directly associates with dRheb and displays guanine nucleotide exchange activity with it in vivo and in vitro. Human TCTP (hTCTP) shows similar biochemical properties compared to dTCTP and can rescue dTCTP mutant phenotypes, suggesting that the function of TCTP in the TSC pathway is evolutionarily conserved. Our studies identify TCTP as a direct regulator of Rheb and a potential therapeutic target for TSC disease.     

异硫氰酸异丁酯抑制肝癌细胞HepG2生长的效应与机理

为了探究异硫氰酸异丁酯(isobutyl isothiocyanate)对肝癌细胞HepG2的生长抑制效应及其分子机制，该研究通过MTT实验检测化合物对细胞的生长抑制率，计算出IC50值为3.5 μg·mL－1；通过流式细胞技术检测发现0.437 μg·mL－1以上浓度的化合物能诱导HepG2细胞凋亡；通过划痕实验检测发现0.875 μg·mL－1以上浓度的化合物能抑制细胞迁移；进一步通过生物信息学分析表明异硫氰酸异丁酯的靶蛋白可能为巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，且HepG2细胞中MIF表达量高于低敏感株.免疫印迹实验也进一步发现化合物不仅能够抑制蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路的激活，还能下调p53蛋白表达.研究结果表明，异硫氰酸异丁酯可能通过靶向HepG2细胞中的MIF蛋白，影响MIF与其受体CD74相互作用，从而下调p53蛋白表达，阻滞细胞周期的正常进行，诱导细胞凋亡，对肝癌具有特异性的抑癌潜力.     

Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice

Autism spectrum disorders (ASDs) are highly prevalent neurodevelopmental disorders, but the underlying pathogenesis remains poorly understood. Recent studies have implicated the cerebellum in these disorders, with post-mortem studies in ASD patients showing cerebellar Purkinje cell (PC) loss, and isolated cerebellar injury has been associated with a higher incidence of ASDs. However, the extent of cerebellar contribution to the pathogenesis of ASDs remains unclear. Tuberous sclerosis complex (TSC) is a genetic disorder with high rates of comorbid ASDs that result from mutation of either TSC1 or TSC2, whose protein products dimerize and negatively regulate mammalian target of rapamycin (mTOR) signalling. TSC is an intriguing model to investigate the cerebellar contribution to the underlying pathogenesis of ASDs, as recent studies in TSC patients demonstrate cerebellar pathology and correlate cerebellar pathology with increased ASD symptomatology. Functional imaging also shows that TSC patients with ASDs display hypermetabolism in deep cerebellar structures, compared to TSC patients without ASDs. However, the roles of Tsc1 and the sequelae of Tsc1 dysfunction in the cerebellum have not been investigated so far. Here we show that both heterozygous and homozygous loss of Tsc1 in mouse cerebellar PCs results in autistic-like behaviours, including abnormal social interaction, repetitive behaviour and vocalizations, in addition to decreased PC excitability. Treatment of mutant mice with the mTOR inhibitor, rapamycin, prevented the pathological and behavioural deficits. These findings demonstrate new roles for Tsc1 in PC function and define a molecular basis for a cerebellar contribution to cognitive disorders such as autism.     

Toxicity of the brominated flame retardant tris-（2,3-dibromopropyl） isocyanurate in zebrafish （Danio rerio）

Tris-(2,3-dibromopropyl) isocyanurate (TBC) is a heterocyclic brominated flame retardant that was recently detected in the environment in China. TBC is semi-volatile and can accumulate in the lipid of some species, but little is known about its effect on aquatic organisms. We exposed adult zebrafish to 0, 0.25, 1 and 4 mg/L TBC for 28 d and measured the effect on survival, growth, histopathology, hormone levels, enzyme activity, and gene expression. TBC exposure had no effect on survival or growth. We observed significant damage to the liver and gill, including hepatocellular swelling and fatty degeneration in the liver as well as proliferation and edema of epithelial cells in the gills. In addition, exposure to 4 mg/L TBC induced proliferation of goblet cells in the intestine of both sexes, acellular areas in the testis, and thinly scattered vitellogenic granules in vitellogenic oocytes. TBC exposure had no effect on the levels of thyroid hormones, testosterone, estradiol, liver superoxide dismutase activity, malondialdehyde content, and brain cholinesterase activity. By contrast, hepatic vitellogenin and cytochrome P4501A gene expression was significantly down-regulated in both male and female zebrafish in response to TBC exposure. Our results suggest that exposure to TBC causes a variety of potential reproductive and endocrine toxic effects.     

小鼠四倍体半克隆胚胎发育研究

半克隆(Semi-Cloned)胚胎是通过注射体细胞核到未去核的卵母细胞中产生的。在半克隆胚胎中,体细胞被用来作为精子的替代物。然而,由于异常的染色体分离,构建的半克隆胚胎在激活后形成了非整倍体而导致胚胎发育受到严重影响,不能发育到期。本研究通过抑制小鼠半克隆胚胎在激活过程中染色体数目减半,避免非整倍体胚胎形成,研究四倍体半克隆(TetraploidSemi-cloned,TSC)胚胎的发育和体细胞核的掺入对胚胎发育的影响。结果显示,TSC胚胎的体外发育率显著高于二倍体半克隆胚胎,与正常受精卵及孤雌激活对照无显著性差异,但TSC胚胎的细胞数在桑椹胚和囊胚期比正常二倍体受精胚胎和孤雌激活胚胎少。通过Oct-4染色发现,TSC胚胎囊胚期内细胞团(InnerCellMass,ICM)细胞很少或者没有。移植63个四倍体半克隆胚胎到3只假孕母鼠体内,得到20个胎盘,但没有得到胎儿。组蛋白乙酰化和DNA甲基化检测显示,部分TSC胚胎在囊胚期没有形成正常受精胚胎在ICM和滋养外胚层(Trophectoderm,TE)之间的差异分布。TSC胚胎的基因表达不依赖于细胞分裂次数而依赖于发育时间。虽然TSC胚胎避免了二倍体半克隆胚胎形成非整倍体现象,但由于TSC胚胎没有ICM细胞或ICM细胞很少,所以只能形成胎盘而不能形成胎儿。本实验第一次较为全面地研究了TSC胚胎的发育,同时也为研究体细胞核再程序化、基因打靶技术提供了一种新的途径。