乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合     

乙型肝为病毒（HBV）DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游,重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达,用纯化后的重组质粒直接注射用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼细内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体,ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合。     

丙型肝炎病毒核酸疫苗的研究

从丙型肝炎病人的阳性血清中提取出丙型肝炎病毒ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得丙型肝炎病毒Ｃ区基因片段。并将此片段克隆到真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），得到重组质粒ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ／Ｃ，再将其通过肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／小鼠后，小鼠产生了抗ＨＣＶ／Ｃ区抗体。     

小鼠B7—1cDNA克隆,测序,表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法,从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后,插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与献报道一致。     

HIV-1和HBV复合型DNA免疫的初步研究

近年的研究表明,在啮齿类和非人灵长类免疫带有编码病毒和细菌抗原基因的质粒ＤＮＡ可以激发体液和细胞免疫应答．在本实验中,将ＨＢＶ的Ｓ基因和ＨＩＶ－１的ｇｐ１６０基因以融合形式插入到载体ｐｃＤＮＡ３中,其能表达ＨＢｓＡｇ和ｇｐ１６０的融合蛋白,并将此质粒ＤＮＡ分别直接注射到Ｂａｌｂ／ｃ小鼠和Ｓｗｉｓ小鼠．三次免疫后,用ＥＬＩＳＡ的方法初步检测ＨＢｓＡｇ和ｇｐ１６０抗原特异的抗体免疫应答均为阳性．结果说明,带有ＨＢＶ和ＨＩＶ－１融合基因的质粒ＤＮＡ直接免疫小鼠后,均激发了小鼠产生相应的免疫应答反应,这个结果为研究和生产多价疫苗提供了新的思路     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用ＰＣＲ技术从层理鞭枝藻总ＤＮＡ中扩增藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的基因,将ｐｅｃＡ克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ;ｔ,然后将ｐｅｃＡ基因插入表达载体ｐＧＥＭＤ,形成的重组质粒在ＢＬ２１（ＤＥ３）中最高效表达,表达蛋白形成包涵体,高效表达的蛋白的分子量为１９×１０＾３,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白。     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

克隆蓝藻Calothrix sp.PCC7601 cpcB2A2基因的初步研究

从蓝藻Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７６０１染色体ＤＮＡ中分离出含藻蓝蛋白基因ｃｐｃＢ２Ａ２的略３．８ＫｂＤＮＡ片段，与质粒ｐＵＣ１８重组，构建成一种重组质粒，ｐＰＣ２１８－ＰＣＺ，转化Ｅ．ｃｏｄｉＪＭ１０９，获得了一系列克隆子，经斑点分子杂交和限制性内切核酸酶分析，筛选出了初步认为含有ｃｐｃＢ２Ａ２基因的克隆子。     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

水动力转染技术建造慢性乙型肝炎动物模型特效研究

摘要: 目的比较不同质粒建立的水动力转染乙型肝炎小鼠模型的特性。方法将pcDNA 3. 1-1. 3-HBV-C 与PAAV-1. 2-HBV-A 两种质粒通过水动力转染法建立两种乙型肝炎小鼠模型,通过对建模成功率和小鼠外周血HBsAg 滴度及稳定性,T 细胞指数流式等检测分析,比较不同模型差异和特效。结果转染pcDNA3. 1-1. 3-HBV-C质粒建模成功率为78. 6%,转染后体内HBsAg 滴度最高达到220IU/mL; 转染PAAV-1. 2-HBV-A 质粒建模成功率为56%,转染后体内HBsAg 滴度最高达到2 300IU/mL。建模小鼠的肝脏进行切片,做免疫组化后,观察实验结果,转染pcDNA 3. 1-1. 3-HBV-C 质粒的小鼠肝脏切片的HBsAg 免疫组化较PAAV-1. 2-HBV-A 质粒小鼠颜色面积更大。实验小鼠转染质粒后6 周的外周血进行流式细胞术检测,结果显示特异性T 细胞CD4 +、CD8 + 和正常小鼠比较,两种质粒的造模小鼠未有差别。结论利用水动力转染法用不同质粒建造乙型肝炎小鼠模型在乙肝病毒指标水平和稳定性方面有着显著差异。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV YMDD变异株的检测

目的观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中,乙型肝炎病毒(HBV)发生 YMDD变异的情况;研究HBV YMDD变异的发生率同拉米夫定用药时间及用药前与血清HBV DNA水平的关系;观察拉米夫定治疗过程中,血清HBV DNA水平的变化.方法 80例慢性乙型肝炎病人被分为2组,1组为拉米夫定治疗组50例,另1组为对照组30例.采用实时PCR技术,并结合荧光探针技术,分别检测拉米夫定治疗组和对照组在用药期间的HBV YMDD变异发生率;采用荧光定量PCR技术检测治疗组在用药前及用药期间血清HBV DNA水平.结果治疗组在用药52周时的HBV YMDD变异发生率为24.0%,明显高于对照组用药52周的变异率3.3%(P<0.05); 治疗组在用药52周的HBV YMDD变异率为24.0%,明显高于用药26周时的变异率4.0%(P<0.05);治疗前HBV DNA水平较高组用药52周时的变异率为35.7%,明显高于HBV DNA水平较低组的变异率9.1%(P<0.05);治疗组中未变异组在用药52周时的HBV DNA阴转率为65.8%,明显高于变异组的HBV DNA阴转率16.7%(P<0.05).结论拉米夫定可导致HBV YMDD变异的产生,并且该变异的发生率随着拉米夫定用药时间延长而增加;治疗前血清HBV DNA水平较高者在应用拉米夫定后易发生YMDD变异;HBV YMDD变异发生后,可出现HBV DNA复升,但一般不会超过治疗前的基线水平.     

Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠的制备

目的：建立Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠模型。方法：构建转基因表达载体,经细胞诱导表达验证后,酶切得到含有CUEDC2的线性DNA片段,并采用显微注射的方法及后续筛选鉴定,得到CUEDC2转基因小鼠。进而通过与乳腺特异表达的MMTV-rtTA转基因小鼠交配,得到CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。利用2mg/ml的多西环素（Doxycycline）诱导小鼠体内CUEDC2表达,通过Western Blot、免疫组化检测表达。结果：经诱导,CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠的2个Founder的F1、F2代在转录水平和蛋白水平均成功表达CUEDC2, 并具有乳腺特异性。结论：Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠制备成功.     

抗乙型肝炎病毒(HBV)S区的siRNA对HBV-DNA的抑制作用

体外观察s1RNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)HBV-DNA分泌的影响。设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZYl、pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转梁HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15 细胞上清中HBV-DNA进行定量检测。结果成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条s1RNA 均可不同程度地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBV-DNA,转染72 h抑制效果最好,分别为62%、31%、63%。说明针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV-DNA。     

A DNA vaccine induces SARS coronavirus neutralization and protective immunity in mice

Public health measures have successfully identified and contained outbreaks of the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus (SARS-CoV), but concerns remain over the possibility of future recurrences. Finding a vaccine for this virus therefore remains a high priority. Here, we show that a DNA vaccine encoding the spike (S) glycoprotein of the SARS-CoV induces T cell and neutralizing antibody responses, as well as protective immunity, in a mouse model. Alternative forms of S were analysed by DNA immunization. These expression vectors induced robust immune responses mediated by CD4 and CD8 cells, as well as significant antibody titres, measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Moreover, antibody responses in mice vaccinated with an expression vector encoding a form of S that includes its transmembrane domain elicited neutralizing antibodies. Viral replication was reduced by more than six orders of magnitude in the lungs of mice vaccinated with these S plasmid DNA expression vectors, and protection was mediated by a humoral but not a T-cell-dependent immune mechanism. Gene-based vaccination for the SARS-CoV elicits effective immune responses that generate protective immunity in an animal model.     

小鼠睾丸发育过程中Si1基因表达的研究

 以1天龄、未成熟(3周龄)、成熟期(10周龄以上)的昆明正常小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的Si1基因探针在其组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交,探讨Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的表达变化.同时,分别在生后15,20 d及25 d的昆明小鼠睾丸组织切片上进行凋亡细胞原位检测,验证小鼠睾丸上述发育时期的细胞凋亡情况.结果发现:①Si1基因在1天龄小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号;在未成熟小鼠的睾丸组织部分生精上皮内有极强的杂交信号;在成熟小鼠的睾丸组织生精上皮内无杂交信号.②小鼠睾丸组织生精上皮内,凋亡细胞数从生后第15-20天呈增加趋势,于生后第20天出现峰值,生后第25天又降低.上述结果表明Si1基因可能参与了小鼠睾丸的发育过程,在小鼠睾丸发育的特定时期发挥作用,由于Si1基因的表达与小鼠生精细胞凋亡发生的时期同步,表明该基因可能与小鼠睾丸发育过程中的细胞凋亡有关.     

Application of a nuclear localization signal gene in transgene mice

Efficient gene transfer by cytoplasm co-injection will offer a powerful means for transgenic animals. Using co-injection in cytoplasm, two independent gene constructs, including bovine α-s1-casein-hG-CSF and a mammal expression vector expressing a nuclear localization signal (mNLS), were introduced into fertilized mouse eggs. The target gene construct was docked into host nucleus probably by the nuclear localization signal. Transgene mice have been obtained at 58% (29/50) of integration ratio. Expression level of the positive transgene mice was detected by Western blotting. Maximal expression of human G-CSF was estimated about 540 mg/L of milk. The expression ratio was up to 75% (9/12). The results here have important practical implications for the generation of mammary gland bioreactors and other transgene studies. Co-injection of a target gene with an expression vector of a mammal nuclear localization signal by cytoplasm appears to be a useful, efficient and easy strategy for generating transgenic animals, which may be able to substitute the routine method of pronucleus-injection of fertilized eggs.     

日本血吸虫体壁抗原基因的筛选与克隆

为筛选并克隆新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)候选抗原基因,以日本血吸虫成虫总DNA为模板,通过生物信息学以及分子生物学手段从日本血吸虫全基因组中筛选目的基因.根据所筛选到的目的基因的核酸序列设计合成引物,用PCR法扩增目的基因,将其克隆入pBS-T载体后转入到大肠杆菌DH5a菌株,筛选阳性克隆.通过对阳性菌落质粒进行PcR予以证实.最终成功筛选并克隆到日本血吸虫体壁候选抗原基因.     

HBs和HCVc基因双顺反子质粒在BALB/c小鼠体内的分布

 采用注射含双顺反子质粒后,PCR法扩增不同组织中HBsAg和HCVc基因,同时检测HBV和HCV抗体应答水平.研究注射基因免疫用双顺反子质粒在小鼠组织中的分布.pcDNA3.0BApc154S₂S 1次注射BALB/c小鼠后,24 h内主要分布于血液、肝、脾、骨髓、淋巴结、注射部位肌肉、肺和肾等含血液丰富的组织中.注射后2 d主要在骨髓、血液和注射部位肌肉中存在.7 d后仅在注射部位肌肉中能检测出来,并可持续到第9周.组织切片镜检质粒注射初期肌肉细胞轻度浊肿,随后肌膜细胞轻度增生,未见其它明显的组织病理学变化.质粒多次免疫BALB/c小鼠未见明显的临床症状和病理组织学变化.质粒在小鼠体内不同组织存在时间不一致.