兔抗小鼠IgG-HRP酶标抗体的制备及应用

制备并纯化小鼠腹水IgG,鉴定IgG纯度;免疫新西兰大白兔制备兔抗小鼠IgG的抗血清并纯化血清IgG;用改良过碘酸钠法制备兔抗小鼠IgG酶标抗体,对其进行鉴定,并与市场上的同类产品对比。结果,纯化的小鼠腹水IgG,其纯度约为80%—90%;免疫新西兰大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价在1：32以上;用改良过碘酸钠法制备酶标兔抗小鼠IgG酶标结合物与市场同类产品相比质量优良,特异性较强,亲和力较好,并在较长时间内效价稳定。结果表明,制备的小鼠IgG抗血清和酶标抗体,适合于小鼠的血清学检测体系的建立。     

噬菌体抗体库的构建

噬菌体抗体库技术是近年来非常活跃的一个研究领域．本文主要讨论噬菌体抗体库构建中一些关键的问题．     

噬菌体抗体库的构建

噬菌体抗体库技术是近年来非常活跃的一个研究领域,本文主要讨论噬菌体抗体库构建中一些关键的问题。     

人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建

利用RT－PCR和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体（抗HBc）阳性患淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体（ScFv）基因，重组于噬菌粒载体pHEN1，转化抑制型大肠杆菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

噬菌体展示蛋白质芯片的无标记检测

为获得丰富的特异识别分子和实现无标记、高灵敏度检测,利用噬菌体展示技术,选择在pⅢ蛋白上展示12肽的噬菌体M13作探针,采用羧基-氨基共价耦联法制备噬菌体展示蛋白质芯片.在此基础上,与表面等离子体共振传感技术结合,使用Biacore3000仪器,检测噬菌体展示蛋白质芯片与特异性抗体的反应,测定反应动力学常数.实验结果表明:当抗体浓度为0.4 μmol·L-1时,响应信号可达365±8个单位;不同浓度的抗体与芯片反应的数据较好地与S型曲线吻合.该方法可望用于噬菌体展示蛋白质芯片的检测.     

抗弓形虫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

采用弓形虫可溶性抗原攻击的小鼠,取小鼠脾脏从中提取细胞总RNA,通过RT-PCR扩增鼠源抗体VH和VL基因,并采用重叠PCR (SOE-PCR)方法构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载体pCANTAB5E中,转化于感受态大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.从20个噬菌体克隆中筛选到15个具...     

从噬菌体抗体库中淘选人绒毛膜促性腺激素的单链抗体

由鼠源噬菌体抗体库淘选到展示有人绒毛膜促性腺激素单链抗体的噬菌体克隆。用ELISA方法进行检测,从结合力最强的克隆中分离单链抗体基因,插入经改造的高效表达载体pET-21a(+)中,转化大肠杆菌,诱导表达。从培养基中可检测到可溶性抗人绒毛膜促性腺激素的单链抗体。     

噬菌体显示抗乳腺癌单链抗体的基因克隆和筛选

克隆和连接乳腺癌杂交瘤单克隆抗体的轻、重链可变区基因，构建该单链抗体的噬菌体显示系统，经严格的相关肿瘤细胞株的固相细胞正负筛选和多步液相结合-洗脱细胞筛选，得到特异性高、亲和力强的单链抗体基因，用于进一步构建重组免疫毒素，为临床乳腺癌和生物靶向治疗奠定基础.     

抗伊氏锥虫单克隆抗体的研究——三、应用酶标单抗ELlSA竞争法检测抗T.e.抗体的实验研究

应用酶标单抗(HRP-MCAbⅡG_6)ELISA竞争法对7只感染伊氏锥虫的家兔血清进行了检测,结果表明该法具有特异、敏感、快速等优点.与间接ELISA检测结果相比呈现明显的正相关,两种方法检测相符合,因此本法可作为流行病学调查和血清学诊断的工具.     

以1-氯萘酚为底物的分光光度法测定辣根过氧化物酶

提出了1-氯萘酚-H2O2-辣根过氧化物酶(HRP)催化动力学光度法测定HRP的新方法.在pH 10.0的B-R缓冲溶液中,HRP催化H2O2氧化1-氯萘酚生成有色化合物,通过测定该有色化合物在波长为580 nm处的吸光度值,间接测定HRP的含量.在所选定的实验条件下,测定HRP的线性范围是3.0×10-9～5.0×10-7 g/mL,检测下限为2.0×10-9 g/mL.此方法可以应用于测定动植物体内的抗原和抗体.     

松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用脱氢松香胺(DHAM)为半抗原合成了松香的完全抗原、并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。首先DHAM与琥珀酸酐(SUC)反应合成琥珀酸单酰脱氢松香胺(DHAM-SUC),然后再与牛血清蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联,合成了松香的完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH,偶联比分别为12和35。以DHAM-SUC-KLH为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,制备了抗血清,效价达1.28×10⁵,脱氢松香酸(DHA)和松香酸(AA)的50%抑制浓度(IC₅₀)分别为25.1μg/L和36.4μg/L。研究合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性,获得的多克隆抗体具有较好的灵敏度,可为建立畜禽肉制品中松香残留的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法打下基础。     

辣根过氧化物酶催化合成聚-4-羟基苯乙烯基吡啶

利用辣根过氧化物酶催化合成了新型共轭聚合物----聚-4-羟基苯乙烯基吡啶, 辣根过氧化物酶的催化氧化反应使底物中的苯环直接聚合. 荧光光谱研究结果表明, 聚合物具有良好的光致发光特性, 辣根过氧化物酶能有效地催化4-羟基苯乙烯基吡啶的聚 合反应.     

用脾内免疫法制备抗人尿激酶单克隆抗体

用常规免疫法制备抗人尿激酶单克隆抗体费时、费样品。本文采用脾内直接注射的免疫方法,利用杂交瘤技术制备了3C_6抗尿激酶单克隆抗体,3C_6单克隆抗体属IgM亚类,主要识别MW 54,000的高分子量尿激酶和MW 33,000的低分子量尿激酶。3C_6单克隆抗体与结构类似的胰蛋白酶和纤溶酶原无交叉反应,与胰凝乳蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶有一定程度的交叉反应。     

半乳糖凝集素PPL13的表达纯化及免疫组织化学研究

在E．coli M15中表达纯化半乳糖凝集素PPL13(placenta protein lectin13)，制备兔抗人PPL13多克隆抗体。以免疫组织化学法检测PPL13在人胎盘及脐静脉的表达情况．结果显示PPL13分布在胎盘及脐静脉的内皮细胞中．提示PPL13可能与胎盘及脐静脉内皮细胞的功能相关．     

用M13DNA探针检测小鼠DNA指纹

用ＨｉｎｆＩ酶切，随机引物法标记的Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ作探针，对无关小鼠个体及一个小鼠家系三代进行了ＤＮＡ指纹分析，无关个体平均每个个体得到１４条谱带（＞４ｋｂ）。无关个体具有相同指纹图概率为９×１０￣（－８），显示高度个体材异性，对小鼠家系内后代与亲本图谱进行了比较，表明图谱特征按孟德尔方式遗传。对家系内个体间遗传相似度Ｄ进行了计算，亲缘关系近则Ｄ值高，据此对本技术在动物个体识别，亲缘关系分析等方面的应用进行了讨论。     

HRP标记β_2-微球蛋白单克隆抗体的研究

用辣根过氧化物酶(HRP)标记β2-微球蛋白单克隆抗体,以此作为ELISA实验的酶标二抗.用过碘酸钠将辣根过氧化物酶(HRP)的糖的部分轻微氧化为醛基,然后与抗体氨基进行反应,形成辣根过氧化酶(HRP)与抗体的结合物.将β2-微球蛋白与过氧化物酶的结合物进行纯化,得到较纯的酶结合物,以此作为ELISA的酶标二抗.     

镉螯合物特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得镉螯合物特异性单克隆抗体, 以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸为双功能螯合剂连接镉离子与钥孔戚血蓝素,牛血清白蛋白合成了免疫原与包被抗原. 经过抗原鉴定,免疫Balb/c小鼠, 取小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤, 经筛选和2次克隆化, 从制备的腹水中获取单克隆抗体. 用酶联免疫吸附测定法鉴定单克隆抗体3A9D9G7的特性,腹水效价为4×10-4, 单抗亚类为IgM, 轻链为κ型, 亲和常数为1.44×1010 mol/L, 其他金属螯合物的交叉反应低于0.9%, 表明该单克隆抗体能特异性识别Cd-EDTA, 为环境样品与食品中镉残留的快速检测提供了工具.     

中央上核向大脑皮质的纤维投射——HRP逆行标记法研究

本文用辣根过氧化物的酶(HRP)逆行标记法对中央上核(CS)向大脑皮质的纤维投射进行了研究。观察结果表明;CS向大脑皮质投射的范围很广泛,除压上回和视区以外的大部分大脑皮质都接受CS的投射纤维,但从整体上看前半皮质多于后半皮质。在各脑区的注射例中,海马的标记细胞最多,其次是隔区,前乙状回,后乙状回和扣带回。标记细胞为中等大小的卵圆形细胞,位于核的中央部。