新型定性-定量测定血红蛋白氧载体的检测系统Ⅲ.建立抗人源性氧载体类兴奋剂检测系统的初探

目的 构建一种高通量蛋白芯片检测人血清中血红蛋白氧栽体类兴奋剂的方法.方法 用自制SEC微柱快速地将人血清中血红蛋白聚合体(氧栽体)和血红蛋白单体(另外加入的内标)分离,逐滴收集洗脱液作为探针,点样结合在蛋白质基片上,与其相对应的荧光标记的多克隆抗体进行杂交,扫描芯片荧光强度检测人血红蛋白氧栽体.结果 自制SEC微柱能够将戊二醛聚合的人血红蛋白聚合体和单体有效分离,在蛋白芯片的检测中能较好地检测出人血清中1.5%的聚合体人血红蛋白氧栽体.结论 以SEC技术和蛋白芯片相结合是一种高通量、灵敏、重现性好的检测人血清中的以人血红蛋白为基质氧栽体类兴奋剂新方法.     

ELISA方法检测人外周血中的IL-18

建立了一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的酶联夹心ELISA方法,可定量检测人外周血中的白细胞介素18(hIL-18)。将体外重组表达的hIL-18蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,纯化兔血清中的抗体IgG,用辣根过氧化物酶(HRP)标记,检测正常人血清样本中的hIL-18。此方法灵敏度高,可重复性良好,且结果数据化。适合于IL-18的临床定量检测,为进一步开展研究提供了有力的工具。     

ELISA方法检测恒河猴血清中抵抗素

目的用ELISA检测试剂盒,探索一种恒河猴血清抵抗素（Resistin）定量的快速检测方法,初步建立各年龄段恒河猴血清抵抗素的正常参考值。方法选择用于人抵抗素检测的ELISA定量检测试剂盒,对恒河猴血清进行抵抗素的测定;按年龄段将实验猴分组,幼年组、成年组和老年组,每组10只,制备血清,检测抵抗素,并进行统计分析,初步建立各年龄段恒河猴血清抵抗素的正常参考值。结果用ELISA定量检测试剂盒测定恒河猴血清抵抗素数值稳定,幼年组、成年组和老年组的血清抵抗素正常参考值分别为（6 510±1 730）pg/mL、（5 880±1 250）pg/mL和（1 760±920）pg/mL,有随年龄增长而逐步降低的趋势,老年组极显著低于幼年组和成年组（P〈0.01）。结论人抵抗素ELISA检测试剂盒可以作为一种对恒河猴血清抵抗素定量的临时快速的检测方法,且随着年龄的增长其血清抵抗素正常参考值有逐步降低趋势。     

非特异性IgG含量对EIA法检测抗-HCV抗体的干扰现象

用酶免疫分析法(EIA)研究了人血清非特异性IgG 在抗-HCV抗体检测中的干扰作用.结果显示:随着正常健康人血清标本(阴性血清)中I gG量的增加,其OD值随之增高,当标本中的IgG含量增加至一定值时即产生假阳性结果.此结果表明非特异性IgG与支持材料(酶标板)非特异性结合可造成对EIA实验结果的干扰作用.这就解释了一些学者报导类风湿性关节炎、自身免疫性肝病、高血清免疫球蛋白血症等患者用EIA法检测抗-HCV时易出现假阳性的原因.     

胶体金免疫层析技术同步检测甲、戊型肝炎病毒IgG抗体的研究

目的探索并建立胶体金免疫层析(GICA)同步检测血清中的甲、戊型肝炎病毒的IgG抗体的方法.方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记鼠抗人IgG单克隆抗体,制成免疫层析测试条.血清中甲、戊型肝炎的特异性IgG抗体与测试条上金标抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动与膜上固相包被的抗原(HAAg,HEAg)、抗体(羊抗鼠lgG)结合形成肉眼可见的红色线条.结果自制的GICA试条与EIA对比检测血清标本188份,各单项指标抗-HAV IgG,抗-HEV IgG两法总符合率分别为98.9%,98.9%,检测灵敏度可达1μg/L.结论用于同步检测血清中的甲、戊型肝炎病毒特异性IgG抗体的GICA试条的制备条件已基本建立,其检测结果特异性强、灵敏度高、操作方法简便快捷且无需特殊仪器设备,有广泛的应用价值.     

BABL/c突变卷毛小鼠免疫学特性指标的分析

目的 探讨BALB/c突变卷毛小鼠与BALB/c小鼠之间的免疫学指标是否存在差异。方法 选择6周龄的BALB/c突变卷毛小鼠和BALB/c小鼠各20只(雌雄各半),分别使用全自动血细胞分析仪检测6项血液免疫细胞指标;使用全自动生化仪检测4项抗体和补体指标;ELISA法检测血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4水平;并对两组结果进行对比分析。结果 两组小鼠NE、NE#和MO的雌性及组间结果相比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),两组小鼠LY的雌性结果相比较具有显著性差异(P<0.05);两组小鼠IgM的性别及组间结果相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),两组小鼠的IgG和C3的雄性及组间结果相比较具有显著性差异(P<0.01),两组小鼠IL-4的雌性及组间结果相比较具有显著性差异(P<0.05)。结论 BALB/c突变卷毛小鼠和BALB/c小鼠的血液免疫学指标存在差异,提示突变基因可能对小鼠的免疫系统产生了一定的影响。     

磷锑钼蓝共振瑞利散射法测定蛋白质

在稀H2SO4介质中, 蛋白质与磷锑钼蓝结合而使共振瑞利散射(RRS)增强并产生一个新的RRS光谱. 以磷锑钼蓝(PSbMo heteropoly blue, PSbMo)-牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为例, 考察了其相应的光谱特征、影响因素和适宜的反应条件. 结果表明:当BSA的浓度在0～6.0 μg/mL范围内与RRS强度成正比. 方法对于测定蛋白质具有高的灵敏度, 对BSA、人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、α-糜蛋白酶的检测限(3σ)分别为0.021 μg/mL, 0.023 μg/mL和0.030 μg/mL. 实验了共存物质的干扰影响, 方法有较好的选择性, 用于合成样品的分析, 结果满意.     

液相芯片技术检测马立克氏病病毒方法的建立

目的 建立检测马立克氏病病毒的双抗夹心液相芯片技术方法。方法 将捕获抗体偶联到19号微球,分别确定捕获抗体的偶联量、检测抗体和SA-PE抗体的工作浓度,用建立的液相芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的分析。结果 1×106个荧光编码微球的抗体偶联量为2 μg,最佳的检测抗体与SA-PE的工作浓度分别为2 μg/mL和4 μg/mL。该方法特异性强,只检出马立克氏病病毒,其他病毒未检出;灵敏度为125 pfu/mL;批内批间的变异系数分别为0.85%和2.4%;对58份临床样品检出率为31%。与PCR方法比较,符合率为94.8%。结论 建立的马立克氏病病毒液相芯片检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点。该方法可用于马立克氏病的监测,也可用于SPF鸡的筛选。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

高通量抗体芯片研究AILD血清炎性因子表达特征

利用微阵列抗体芯片技术检测53例自身免疫性肝病(AILD)患者血清中20种辅助性T细胞相关炎性因子的表达水平,结合肝功能临床生化数据,分析炎性因子的表达特征和差异性.高通量抗体芯片检测结果显示:AIH-PBC OS患者血清中IL-4和TGFβ1表达量水平显著高于PBC组(P0.05),AIH-PBC OS患者血清中IL-4表达量水平显著高于健康对照组(P0.05),PBC患者血清中IL-4和TGFβ1表达量水平显著低于健康对照组(P0.05).PBC患者血清中TGFβ1表达量与ALT(r=-0.6301,P=0.0135)、AST(r=-0.7443,P=0.0030)呈显著负相关.结果表明:IL-4和TGFβ1在AIH-PBC OS患者和PBC患者血清中表达量差异(P0.05)和TGFβ1表达量与AILD患者肝功能指标间的相关性为筛选具有临床检验、诊断、治疗和预后监测意义的AILD相关细胞因子奠定了基础.     

DNA微阵列方法与应用

本文系统扼要介绍了DNA微阵列的技术方法和应用。包括DNA微阵列的制造原理、杂交和检测的方法,数据结果分析方法,DNA微阵列应用范围,优缺点和发展趋势。     

基因工程的研究现状与前景

综述了基因工程在植物、动物、医药、环保等领域的研究成果及研究进展,并对基因工程的发展前景作了展望。     

肝癌差异表达基因HCUTAL2在酵母Pichia pastoris中的表达

利用正常肝组织和肝癌组织的mRNA,通过逆转录方法,将Cy3和Cy5二种荧光分别标记到2种组织的cDNA上,制备成cDNA探针,并与包含4096条各种人类基因的DNA表达谱芯片进行杂交及扫描,重复11次实验,通过计算机数据处理判定基因是否在上述2种组织中存在表达差异,从而鉴定参与肿瘤发生的基因,其中1类差异表达基因为CUTA的高度同源基因,该基因可能参与重金属离子在体的代谢,对该基因拟编码的蛋白质进行酵母表达。     

人原肌球蛋白结合蛋白3(TMOD3)cDNA的克隆及功能初步分析

从人的胎脑cDNA文库到中克隆到1条人原肌球蛋白结合蛋白3（TMOD3）基因,该基因cDNA序列长1402bp,可以编码352个氨基酸残基组成的蛋白,与大鼠,果蝇和线虫的原肌球结合蛋白同源性分别为82％,41％和35％,TMOD3基因定位在人15q21.1-q21.2,位于遗传位标D15S146和D15S117之间,采用基因芯片杂交的方法研究其表达谱概况,发现该基因在多种,组织和细胞中均表达。     

非修饰性寡核苷酸芯片用于HLA-DQA分型的初步研究

利用非修饰寡核苷酸基因芯片技术,根据HLAⅡ类抗原DQA位点不同基因亚型的特异性序列设计探针,制成分型芯片;待测样本经PCR反应标记上荧光之后,与探针在芯片上进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值,确定样品DQA位点基因亚型。将这一方法应用于125例临床样本和10例标准品的HLA-DQA分型,该方法分型的结果与准确结果相比,准确率达到93.3%。实验结果表明:非修饰性寡核苷酸芯片用于HLA-DQA分型技术可行。     

锌指结构基因ZNF302序列的克隆与表达谱分析

从人脑脑cDNA文库中克隆到1条1685nt的锌指蛋白新基因cDNAycb gq ,命名为ZNF302,生物信息学分析表明,ZNF302的C末端含有13个保守的C2H2锌指结构;Northern-blot结果提示这一基因可能存在3．0kb和4.2kb的2种转录本。Unigene软件包分析,该基因定位于19号染色体19q13.2-13.3;cDNA基因芯片检测显示疤痕成纤维细胞经TGFβ1刺激和ECV304细胞经PMA,LPS刺激后,ZNF302基因表达明显升高,提示其与细胞增殖的正调控有关。     

得克萨斯红末端修饰单链DNA探针微阵列ZrO2陶瓷小珠的发光特性研究

以N ( 4 马来酰亚胺氧化丁酰 ) 琥珀酰亚胺磺酸钠盐 (Sulfo GMBS)为偶链剂将 5 NH2 /3 Tex双末端修饰DNA探针偶链到 3 0 0 μmZrO2 陶瓷小珠表面上 ,制成了发红光的陶瓷小珠 .理论研究表明 ,小珠表面上 2 0 mer单链DNA探针之间的分子间距和微阵列密度是偶链反应溶液中DNA探针浓度、小珠数目和小珠大小的函数 .在优化条件下 ,2 0 mer单链DNA探针在小珠表面微阵列的最小分子间距约为 8 0nm ,因而在一个 3 0 0 μmZrO2 陶瓷小珠表面有10 10 数量级的 2 0 mer单链DNA探针进行微阵列 .     

利用基因芯片分析人era基因表达降低后细胞周期蛋白表达的变化

为了探讨利用RNAi封闭肿瘤细胞系的era基因表达后细胞周期相关蛋白的变化,实验利用Trizol法提取总RNA,用人细胞周期相关基因cDNA芯片检测细胞周期相关蛋白的表达。生物信息学分析结果显示：封闭肿瘤细胞系的era基因表达后,有10条细胞周期相关基因表达上调,7条基因表达下调,为研究人era基因的功能提供了线索。     

cDNA芯片应用在急性白血病研究中的初步探索

基因芯片技术对肿瘤基因组学的研究提供了一种高效的手段．采用基因芯片技术观察了14例初发急性髓系白血病患者12800条基因的表达谱,找到了一些和白血病发生有密切关系的基因．用表达谱的聚类方法分析难治性白血病的基因表达特征,发现一些与耐药相关的基因在难治性白血病人和易治性白血病人中表达有明显不同,证明难治性白血病与耐药有一定关系。