水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

利用CRISPR /Cas9技术快速创制香型“秀水134”水稻

以目前上海市主栽的高产常规水稻"秀水134"为材料,利用CRISPR/Cas9技术成功敲除甜菜碱醛脱氢酶2基因,获得了两种类型纯合突变体植株.采用表达载体特异性结合的引物检测T_1代转基因植株,成功获得6株不携带载体骨架的转基因植株.定量PCR分析显示,突变体植株甜菜碱醛脱氢酶2基因表达量极显著低于野生型对照(p0.01),但突变体植株成熟种子香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)含量极显著高于野生型对照(p0.01).比较野生型对照与突变体植株的主要农艺性状和产量性状,两者间都没有显著差异(p0.05).本研究可为加快高产香型水稻在上海及周边地区的推广应用,以及为今后利用CRISPR/Cas9技术快速培育其他高产香型水稻新品种研究奠定基础.     

孤独谱系障碍相关基因dia1r斑马鱼突变体的构建及行为学表型探析

dia1r基因是人类孤独症谱系障碍相关基因.临床研究发现,缺失dia1r可能会导致患者面部畸形、智力障碍和语言发育迟缓等症状.目前,对dia1r基因的功能及分子机制知之甚少,仅有少数在鸡胚、斑马鱼、小鼠中的表达定位研究.本文通过CRISPR/Cas9系统构建了dia1r敲除的斑马鱼突变体模型,成功获得了稳定遗传的纯合突变体.对突变体进行行为分析发现,与野生型斑马鱼相比,纯合突变体幼鱼的自发运动能力降低,趋触性减弱,对光暗交替刺激更加敏感.在成鱼社交偏好实验中发现,雄性纯合突变体比野生型表现出较弱的社交偏好.     

一个水稻bHLH转录因子的反向遗传学分析

b HLH类型转录因子对于植物开花具有重要的调控作用.为了揭示b HLH转录因子在短日照植物水稻中的功能,利用反向遗传学方法构建了水稻Osb HLH1基因过表达载体,获得过表达转基因植株,分析目的基因在过量表达条件下的功能.结果表明:过表达Osb HLH1能够导致水稻的抽穗期推迟;Osb HLH1在水稻中的表达还具有光周期昼夜节律性,无论是在长日照还是在短日照条件下,Osb HLH1都在夜间具有表达高峰.组织特异性表达结果表明:Osb HLH1在水稻的不同器官中都有表达,但在叶片中表达较高,与光周期相关基因的表达吻合.     

水稻类成花素家族成员OsFTL5和OsFTL6双突变体的创建与分析

为了揭示水稻中类成花素家族(FT-like)成员的生物学功能,利用CRISPR-Cas9技术对OsFTL5和OsFTL62个成员进行基因编辑,以期得到编辑突变体.在OsFTL5基因的编码区选择了2个靶位点5T1和5T2,与OsFTL6基因的编码区选择的靶位点6T1分别组合后,构建了2个融合sgRNA表达框(U6a::6...     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

基于CRISPR/Cas9的毛果杨bHLH106转录因子的功能研究

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制毛果杨(Populus trichocarpa)bHLH106(Basic Helix-Loop-Helix 106)基因的突变体,分析植株的表型特征,初步揭示PtrbHLH106基因在毛果杨木材形成过程中的功能。方法 基于前期对毛果杨野生型(WT)茎干的不同细胞类型(形成层、木质部和韧皮部细胞)RNA-seq数据,克隆得到一个在形成层及木质部较高表达的bHLH基因PtrbHLH106。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制毛果杨PtrbHLH106的功能缺失突变体。对生长60、90、120 d的毛果杨ptrbhlh106突变体和WT植株进行表型观察;对生长120 d的植株各茎节进行石蜡切片,利用甲苯胺蓝染色观察并进行细胞统计分析。结果 获得毛果杨ptrbhlh106突变体;与WT相比,突变体植株的株高、地径无明显差异;在整个测量的生长周期中,第8茎节长度有缩短的趋势,茎节数量有增加的趋势;形成层细胞层数有增加的趋势但差异不显著,导管细胞孔径显著增大,纤维细胞数量显著减少。结论 ptrbhlh106突变体与WT植株在导管孔径和纤维细胞数量上存在差异,初步证明PtrbHLH106基因参与了调控毛果杨次生木质部的发育。     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

水稻OsGASR4基因及其启动子的克隆与表达分析

对前期克隆的水稻GAST基因家族新成员OsGASR4开展研究,利用DNAMAN软件分析水稻OsGASR4进化树;检测GA处理野生型和d 18水稻突变体后OsGASR4表达变化;利用RT PCR方法分析该基因的时空表达特性;克隆了该基因上游长约2 082 bp调控序列,并利用网络工具预测启动子顺式作用元件,构建OsGASR4启动子GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的水稻遗传转化.结果表明:OsGASR4蛋白具有典型的GASA保守结构域,启动子里含有多个与激素响应元件、光诱导相关元件以及逆境胁迫响应元件;GA_3处理降低了OsGASR4转录水平;RT PCR检测和GUS染色的结果表明,OsGASR4在水稻茎和幼穗的表达量相对较高.表明OsGASR4可能作为GA信号途径的抑制因子参与水稻茎和穗的早期发育.     

孤独谱系障碍相关基因dialr斑马鱼突变体的构建及行为学表型探析

dialr基因是人类孤独症谱系障碍相关基因.临床研究发现,缺失diaJr可能会导致患者面部畸形、智力障碍和语言发育迟缓等症状.目前,对dialr基因的功能及分子机制知之甚少,仅有少数在鸡胚、斑马鱼、小鼠中的表达定位研究.本文通过CRISPR/Cas9系统构建了dialr敲除的斑马鱼突变体模型,成功获得了稳定遗传的纯合突...     

拟南芥AtRAC在盐胁迫应答中的功能研究

本实验所研究的拟南芥AtRAC含有两个RING结构域和三个蛋白激酶C保守区域1结构域即C1结构域.通过体外泛素化证明了AtRAC具有E3连接酶活性,亚细胞定位实验结果表明AtRAC定位在细胞核中.组织特异性分析表明AtRAC在根中的表达量很高,但是在茎、叶和花中的表达量较低,而且AtRAC的表达受到NaCl胁迫的诱导.进一步对atrac突变体的分析表明,在NaCl处理下,突变体atrac的萌发率降低,侧根数目也降低.初步研究表明拟南芥AtRAC可能是一个与盐胁迫应答相关的基因.     

拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

水稻成花素基因Hd3a在ABA调控种子萌发中的功能研究

Hd3a(Heading date 3a)是拟南芥成花素基因FT(Flowering Locus T)的同源基因，作为水稻开花的强诱导因子，对短日照条件下水稻的开花具有重要的促进作用。Hd3a在水稻发育中是否具有其他功能，目前的认识仍非常有限。在我们的研究中，通过对Hd3a基因组序列进行生物信息学分析，发现Hd3a的启动子序列包含响应脱落酸(Abscisic Acid, ABA)信号的ABRE(ABA-Responsive Element)元件。荧光素酶发光反应和RT-qPCR分析都证实了Hd3a的转录表达随外源ABA增加而减少。通过不同浓度的ABA处理水稻野生型和hd3a缺失突变体种子，结果表明hd3a缺失突变体种子萌发明显被抑制，暗示了Hd3a缺失导致种子萌发中对ABA敏感性增强，同时hd3a突变体中ABA信号途径响应基因ABI5(ABA Insensitive 5)、ABL1(ABI5-Like1)的表达量升高，表明Hd3a可负调控ABA信号。综上所述，Hd3a可以响应ABA信号调控水稻种子萌发，这些研究结果对于深入理解水稻Hd3a基因的生物学功能具有重要意义。     

水稻HD-Zip Ⅲ家族成员OsHox10的功能分析

为了探究HD-ZipⅢ家族成员之一OsHox10在水稻发育中的功能,构建了OsHox10的过量表达载体并获得了转基因株系,明确了OsHox10基因的表达模式和亚细胞定位,并初步了解它与植物激素及抗旱性的关系.表型观察发现,过量表达OsHox10能使水稻叶片出现不同程度的皱缩、卷曲,尤其是靠近叶鞘部分卷曲明显. OsHox10基因的组织特异性表达结果表明,OsHox10在水稻不同器官中都有表达,但主要在分裂旺盛的部位,如茎顶端分生组织及不同时期的幼穗中表达量较高.亚细胞定位结果表明,OsHox10定位于细胞质中或者细胞膜上.分析OsHox10在植物激素及干旱条件处理下的表达,结果发现,激素及干旱处理均能够诱导OsHox10基因的表达,表明OsHox10可能与水稻响应激素信号和干旱胁迫有关.     

Fibrillins突变体对拟南芥开花时间的影响

本研究所使用突变体为fbn8和fbn1a为研究对象,以杂交的方法获得fbn1a/fbn8双重突变体.对Fibrillins突变体在不同的环境下FBN1a、FBN8对开花时间调节的可能机制进行初步探究.研究发现,Fibrillins突变体在长日照、短日照条件下均为早花,并且fbn1a/fbn8双重突变体早花现象更为明显.说明FBN1a、FBN8有可能共同在开花途径中起到作用.通过连续对突变体开花基因的检测发现,和单突变体相比,fbn1a/fbn8双重突变体中的FT、SOC1、CO的基因表达量都大幅度增加,其中FT增加的更为明显,FLC减少也更为明显.而与野生型相比较,这种现象单突变体fbn1a又要比fbn8更为明显.最后,通过检测了植株体内H2O2含量的变化发现,与野生型比较fbn8、fbn1a和fbn1a/fbn8体内H2O2含量升高程度为20%、30%、50%.由实验结果推测Fibrillins可能通过影响体内H2O2含量变化来参与开花时间的改变.     

拟南芥钙依赖型蛋白激酶突变体cpk3-1和cpk6-1 PCR鉴定及其在CO_2通路中的作用

植物中钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPK)是一种重要的感受Ca2+流的传感器,广泛参与到气孔运动和响应各种胁迫刺激的信号转导途径中。研究通过获得拟南芥纯合突变体cpk3-1,cpk6-1和cpk3-1/cpk6-1,研究了CPK3与CPK6在CO2信号通路中作用。结果显示,编码离子通道的基因在不同浓度的CO2处理时表达量会发生变化,但在突变体cpk3-1,cpk6-1,cpk3-1/cpk6-1中,与野生型相比,这些基因的表达量没有差异,表明在CO2信号通路里,CPK3和CPK6可能不发挥作用。     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

拟南芥中一个参与盐胁迫应答基因的T-DNA插入纯合突变体的鉴定及表型分析

本研究以拟南芥为试验材料,探索基因at5g66070在受到非生物胁迫的表达情况,并研究其抗逆特性.结果表明,在NaCl处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到盐的诱导.通过PCR和RT-PCR在DNA和RNA水平上筛选鉴定at5g66070基因T-DNA插入纯合突变体.分析了野生型拟南芥与突变体在不同浓度NaCl处理下,其萌发率,根长以及苗期的生长差异.结果发现,相对于野生型来说,突变体对盐更敏感.具体来说,在含有150mMNaCl的MS培养基中,突变体的萌发率比野生型要低,根长比野生型要短,同时突变体幼苗更容易出现枯萎,萎黄症状.