牡丹江火山口原始森林苏云金芽孢杆菌的分离和cry基因鉴定

对牡丹江火山口原始森林苏云金芽孢杆菌的分布与基因多样性进行研究.采集91份土壤样品,利用温度筛选法从中分离出40株苏云金芽胞杆菌并对其进行光学显微观察,晶体形态为球形和菱形.PCR-RFLP鉴定结果表明:该地区的苏云金芽胞杆菌含有cry1,cry2,cry4,cry8,cry9,cry18,cry26,cry28,cry35基因,含cry8基因的菌株最丰富;苏云金芽孢杆菌在火山口原始森林的分布具有良好的多样性.     

源于地衣的苏云金芽孢杆菌分离及PCR-RFLP分析

以非维管植物地衣为分离材料,采用热处理加抗生素及醋酸钠的方法,经常规形态学鉴定,分离到6株苏云金芽孢杆菌.为了解其生物学特性,分别对这6株菌株进行生理生化测定和cry基因的PCR-RFLP检测,结果显示: 6个菌株均含有cry1、cry1I 、cry2基因,所有菌株均不含cry3、cry4、cry5、cry6、cry8、cry10、cry11基因.初步确定6株菌株中含有5种 cry1亚类基因(cry1Ad,cry1Ba,cry1Cb,cry1Da,cry1Ea),1种cry2亚类基因cry2Ac,2种cry1I基因亚类(cry1Ia1、cry1Ib1),其中有2个菌株的PCR-RFLP图谱均出现特异性片段,推测可能存在新基因.     

苏云金芽孢杆菌cry1I基因沉默的研究

分析了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry1和cry1I基因的保守区,在cry1类基因的下游和cry1I基因的上游设计了一对通用引物,用于检测cry1I与cry1类基因的连锁现象.从鉴定的142株Bt分离株中,PCR扩增发现71株出现约1.4kb的阳性带,说明这一现象广泛存在于Bt菌株中.在此基础上用pGEM-T Easy载体克隆了菌株Bt07和J8中的连锁序列,序列分析表明,Bt07中是cry1I基因与cry1Db基因连锁,间隔区为504bp;J8中是cry1Ia基因与cry1Ac基因连锁,间隔区为506bp.进一步比较间隔区序列,同源性达93.7%,同时含有多个原核生物终止序列,且未发现启动子序列,揭示了这两个菌株中cry1I基因沉默的成因.     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的PCR-RFLP鉴定分析

利用PCR—RFLP技术对含有已知cry1基因的8株标准菌株和2株遗传工程菌进行了基因分析，证实了该方法的可行性．并在此基础上鉴定了分离保藏的70株B．t菌株的cry1型基因，结合SDS—PAGE分析以及室内生物测定结果，讨论了基因型与蛋白表达及毒力之间的关系．     

通过遗传转化获得含多基因的水稻转基因纯合植株

利用基因枪法将含有4个不同基因的3个质粒共转化由粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织（5－10d龄）。从轰击的986块愈合组织中共再生出169株独立的转基因水稻植株（转化率为17％）。PCR／Southern blot分析显示70％以上的转基因植株含有所有4个基因。GUS组织化学分析、Western blot和或RT－PCR分析表明所有4个基因的共表达率为70％。未观察到任何质粒在整合中存在优势,转基因拷贝数也与基因表达量无关。遗传分析证实外源基因在后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔方式遗传的后代R2代植株中,鉴定含有3个或4个不同基因的转基因纯合植株系。PCR／Southern blot分析证实了这些转基因纯合植株系。这些系的植株具有相似的外源基因表达量。我们证实通过基因枪介导的共转化,结合常规育种方法筛选可以获得含多基因的转基因水稻纯合植株。这项技术为利用基因同时改良作用多个性状提供了一种途径。     

枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径基因修饰及效应

在核黄素操纵子过表达的枯草芽孢杆菌中,采用无标记基因敲除方法,分别敲除GMP还原酶基因(guaC)、腺苷琥珀酸合成酶基因(purA)、嘌呤操纵子(pur operon)阻遏蛋白编码基因簇(purR-yabJ),并且用cryⅢA mRNA稳定子替换嘌呤操纵子的mRNA前导区,构建了菌株LX35.采用实时定量PCR方法,测定其胞内嘌呤操纵子mRNA的相对水平.摇瓶发酵,测定其发酵液中的核黄素含量.结果显示,菌株LX35嘌呤操纵子的mRNA水平相对提高了53.33倍,核黄素产量提高了126.6%.使用cryⅢA mRNA稳定子,能够有效提高嘌呤操纵子的表达水平,有助于核黄素过量合成.     

杀线虫基因 cry6A 的克隆、表达及序列分析

利用设计的杀线虫基因cry6A的检测引物对本实验室保存的874株苏云金杆菌进行了PCR筛选,其中仅有四株含有cry6A基因.克隆了苏云金杆菌96860-8的cry6A基因,并在大肠杆菌JM103中表达.通过对秀丽线虫的生测,证实了Cry6A对线虫的毒性作用.氨基酸序列分析发现Cry6A具有一些独特的结构.     

牛奶中苏云金芽胞杆菌的分离与鉴定

采用醋酸钠．抗生素分离法对超市牛奶样品进行苏云金芽胞杆菌（Bacillus thurgngiensis,Bt）的分离,获得2株Bt菌株,分别命名为BtBRC—LJ1和BtBRC-LJ2。利用PCR方法对Bt BRC-LJ1和BtB RC-LJ2菌株幼皿和nheC肠毒素基因的分布进行检测。结果显示,这2个菌株均含有这两种肠毒素基因。     

杂色鲍( Haliotis diversicolor Reeve) 消化腺细菌的初步研究

从正常杂色鲍（无病症,腹足吸附力强）的消化腺分离到5个细菌菌株：1－1－3,3－1－1,4－1－1,5－3－3,5－4－3。经VITEK－AMS－60自动鉴定系统鉴定,前4株均为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）,后1株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)。溶藻弧菌4个菌在形态、生理生化鉴定上虽有差别,但基本上是一致的。5－4－3恶臭假单胞菌与其它4株 差别较大。溶藻弧菌4菌株对卡那霉素等12种药物敏感,对青霉素G等7种药物有耐受性,恶臭假单胞菌对卡那霉素等8种药物敏感,对青霉素G等15种药物有耐受性。     

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.     

杀虫防菌Bt工程菌的构建

N-乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）是革兰氏阴性细菌胞间通讯的信号分子,能够调控许多植物病原菌的致病基因的表达,但如果内酯酶将其水解,则会影响病原菌的致病活性,植物就不会染病。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）,作为生物杀虫剂已有多年使用的历史,本研究通过生物技术手段成功地构建了携带信号分子AHL水解酶基因的穿梭载体pHTss10304,并转入到具有Bt中,构建成工程菌Bt24、工程菌Bt33、工程菌Bt34和工程菌Bt36。通过设计,实现了Bt工程菌的多功能改造,为BT工程菌的应用提供了更为广阔的空间,为生物防治菌的开发现有菌剂提供了新的思路。     

酒鬼酒制曲车间产淀粉酶细菌筛选和系统发育

采用平板水解圈法对酒鬼酒制曲车间空气的细菌进行产淀粉酶活性筛选,运用基于16SrRNA基因序列的分析法对高酶活菌株进行系统发育分析.研究结果表明,65株受试菌株中,有24.6%的菌株(16株)淀粉水解酶活性呈阳性,其中有4株(JSM 2145008,JSM 2155001,JSM 2155017,JSM 2175012)产淀粉水解酶能力较强.基于16SrRNA基因序列的系统发育分析表明,这4个菌株分别属于细菌域3个大的系统发育类群中3个科的3个属.菌株JSM 2145008属于放线菌门微球菌科,与节杆菌属(Arthrobacter)的氧化节杆菌的系统发育关系最为密切,它们之间的16SrRNA基因序列相似性高达99.8%,且在系统进化树上形成一个稳定的亚分支;菌株JSM 2155001和JSM 2175012属于异常球菌——栖热菌群异常球菌科的异常球菌属(Deinococcus),分别与该属的大琼异常球菌和云威异常球菌系统发育关系最为密切(序列相似性分别为99.6%和99.9%);菌株JSM 2155017属于厚壁菌门芽孢杆菌科,与芽孢杆菌属(Bacillus)的同温层芽孢杆菌系统发育关系最为密切(序列相似性为100%),它们以极高的自展值支持(boostrap value,100%)在系统进化树上聚在一起.上述实验结果表明,酒鬼酒制曲车间空气源细菌中存在较高比例的产淀粉酶菌株,且这些菌株具有较高的类群多样性.     

植物抗虫基因工程研究进展

近年来 ,植物抗虫基因工程研究取得了令人瞩目的成果 .根据植物抗虫基因的来源 ,全面综述了利用Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制基因、外源凝集素基因、昆虫神经毒素基因等开展植物基因工程的研究概况 ,并且就其新进展、出现的问题和解决途径进行了讨论 .     

具有ACC脱氨酶活性的绞股蓝根际细菌的分离鉴定及其促生作用

为了筛选含ACC脱氨酶的根际促生细菌,以1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)为唯一氮源,从绞股蓝根际土壤中富集和分离ACC脱氨酶阳性细菌,利用α-丁酮酸测定法和CAS平板法分别检测其ACC脱氨酶活性和产嗜铁素能力,利用菌液培养接种法检测细菌的促生作用,最后通过生理生化试验和16SrRNA基因序列分析对所筛选的菌株进行鉴定.经富集筛选法从绞股蓝根际土壤中分离出9株ACC脱氨酶阳性细菌,它们均具有不同程度的ACC脱氨酶活性,其中3株细菌能产生嗜铁素.促生试验结果表明,7株ACC脱氨酶活性细菌对水稻幼苗根系的生长发育表现出不同程度的促生作用,其中菌株JDG127的促生作用最明显,与对照组相比,水稻幼苗的根长和根鲜重增长了约1.6倍.鉴定结果表明,9株细菌中1株属于单胞菌属(Stenotrophomonas),1株属于类芽胞杆菌属(Paenibacillus),1株属于芽孢杆菌属(Bacillus),2株属于肠杆菌属(Enterobacter),4株属于不动杆菌属(Acinetobacter),与ACC脱氨酶相比,铁载体对根际细菌的促生作用更明显.     

Ubi1 intron-mediated enhancement of the expression of Bt cry1Ah gene in transgenic maize (Zea mays L.)

The cry1Ah gene was one of novel insecticidal genes cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8. Two plant expression vectors containing cry1Ah gene were constructed. The first intron of maize ubiqutin1 gene was inserted between the maize Ubiquitin promoter and cry1Ah gene in one of the plant expressing vectors (pUUOAH). The two vectors were introduced into maize immature embryonic calli by microprojectile bombardment, and the reproductively plants were acquired. PCR and Southern blot analysis showed that foreign genes had been integrated into maize genome and inherited to the next generation stably. The ELISA assay to T1 and T2 generation plants showed that the expression of Cry1Ah protein in the construct containing the ubi1 intron (pUUOAH) was 20% higher than that of the intronless construct (pUOAH). Bioassay results showed that the transgenic maize harboring cry1Ah gene had high resistance to the Asian corn borers and the insecticidal activity of the transgenic maize containing the ubi1 intron was higher than that of the intronless construct. These results indicated that the maize ubi1 intron can enhance the expression of the Bt cry1Ah gene in transgenic maize efficiently     

Li-LSX分子筛制备及其氮气吸附性能研究

采用两步水热法合成低硅铝比沸石（LSX）,用SEM、TG—DTA和激光粒度分析仪对其进行表征与分析;用水热交换法以Na或K离子为过渡离子,以NH4-LSX为中间产物,在碱性条件下制备Li—LSX,并用BEL比表面分析仪和原子吸收光谱仪对氮气吸附量和锂离子交换度进行表征．结果表明：制备的LSX粒度均匀、结晶度和热稳定性良好,但Li—LSX的热稳定性有所下降;以K离子为过渡离子,NH4-LSX为中间产物制备的LbLSX氮气吸附容量可达到26mL／g,Li离子交换度达到97．1％,LiOH的利用率达到90％以上．     

新疆块根芍药内生细菌XJU-PA-4的鉴定及特性分析

采用琼脂扩散法检测了从新疆块根芍药（Paeonia anomala）中分离获得的内生菌XJU-PA-4对植物及动物病原菌的抑菌作用,并对其进行鉴定及特性分析。实验结果表明：（1）XJU-PA-4对玉米小班病菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性,抑菌圈直径分别达到25mm及18mm。（2）XJU-PA-4的16S rDNA序列与Bacillus subtilis strain WL-6的同源性为99％,G＋Cmol％含量为53．5％。结合形态学观察及生理生化特性,最终将XJU-PA-4鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,在GenBank数据库的注册号为EU714296。     

Insecticidal activity of residual Bt protein at the second trophic level

Since the first commercial release of transgenic crop expressing genes from Bacillus thuringiensis (Bt), there have been concerns about its potential impact on the environment. Research has focused on the ecological effects from second exposure to Bt prot…