盐离子对微生物谷氨酰胺转胺酶热稳定性的影响

微生物谷氨酰胺转胺酶(Microbial transglutaminase,MTG)已被广泛用于改善食品质构和特性,但由于其热稳定性较差,限制了它的应用范围.作者研究了不同盐离子对其热稳定性的影响.采用向MTG酶液中添加不同浓度的盐溶液,经50~60℃热处理后,测定处理液的残留酶活的方法.结果表明:经过热处理后,添加氯化钠和氯化钾使MTG的酶活残留率显著提高,并且随着浓度的增加,残留率提高的幅度也增大,经过55℃热处理后,添加20%氯化钠和添加20%氯化钾使酶活残留率分别提高了36.7%(P<0.01)和32.04%(P<0.01);添加氯化镁和氯化钙使MTG的酶活残留率降低,并且随着盐浓度的增加,残留率降低的幅度也增大,经过50℃热处理后,添加20%氯化镁和添加20%氯化钙使酶活残留率分别降低了47.56%(P<0.01)和64.02%(P<0.01).     

微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化

对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21（DE3）进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明：谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.     

产谷氨酰胺转胺酶菌株的生理生化特征

以从土壤中分离得到的产谷氨酰胺转胺酶菌株H-197为研究对象,研究了其在固体培养基中的形态学、生理生化特性,初步鉴定其为链霉菌属(Streptomyces sp).同时研究了表面活性剂和抗氧化剂对酶产量的影响.结果显示,0.1%的PEG2000和1 mmol/L的GSH对酶的产生有一定的促进作用.     

微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)的分离纯化

利用产谷氨酰胺转胺酶的H-197菌株发酵产生MTG,发酵液通过高速离心、冷冻浓缩、乙醇沉淀、冷冻干燥,制得粗酶粉,粗酶粉溶解后经过SephadexG-75柱得到较纯酶样,结果表明:经冷冻浓缩、乙醇沉淀后其活力回收率为44.6%,酶的比活为0.83 U/mg.较浓缩前增加了2.43倍;粗酶经Sephadex G-75凝胶过滤层析后得到较纯的酶,酶的比活力为1.44 U/mg,最终纯化倍数达7.08.     

谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母菌的初步表达

从重组菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经Sac I酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

重组谷氨酰胺转胺酶基因的原核表达研究

采用基因重组手段构建了含重组谷氨酰胺转胺酶基因的菌株E.coli BL21/pET30α-MTG(DE3).研究了诱导剂浓度、诱导时间、温度和转数等对重组体表达的影响,确定了融合蛋白pET30α-MTG的最佳表达条件. 结果表明:当摇菌转速250 r/min,IPTG终浓度1.0 mmol/L,温度37 ℃时,诱导培养4 h可得最大表达量.     

谷氨酰胺转胺酶发酵培养基的响应面分析优化

利用SAS（Statistical Analysis System）软件中二水平设计的Plackett-Burman设计和响应面分析法（Response Surface Analysis，简称RSA），研究了链霉菌（Streptomyces sp.）HS-1摇瓶发酵生产谷氨酰胺转胺酶的发酵培养基.通过二水平设计实验考察了八种因素对发酵生产谷氨酰胺转胺酶的影响，利用极差分析确定其中以豆饼粉水解物、甘油以及硫酸铵为影响链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的重要因素.通过响应面分析法建立了这三个重要因素的二次回归模型，应用规范分析找到最优点，分别为豆饼粉水解物24.0 g &;#8226; L^-1，甘油24.4 g &;#8226; L^-1，硫酸铵5.40g &;#8226; L^-1.摇瓶实验表明，应用优化培养基谷氨酰胺转胺酶酶活由6.27 μ &;#8226; mL^-1提高到7.30μ &;#8226;mL^-1，提高了16.4%.     

茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因克隆、序列分析及原核表达

以茂原链霉菌(Streptomyces m obaraensis)的基因组DNA为模板,利用PCR的方法扩增出谷氨酰胺转胺酶(Transglutam inase,TGase)的完整基因片段.序列分析结果表明,该片段全长1 246 bp,包含一个完整的ORF,长度1 146 bp,编码395 aa,分子量为44 kD左右.该基因的核酸序列及推导的氨基酸序列同已知微生物来源的若干TGase相比,序列相似性均很高,并且发现与酶催化活性有关的一些motif,如酰胺化位点等;在此基础上,又进一步对其二级结构进行分析并完成了TGase三维结构的建模.将编码TGase酶的基因片段插入到原核表达载体pQE30Xa中,并转化大肠杆菌(E.coliJM109).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后该基因得到表达,表达产物的酶活为2.2 U/mL.     

谷氨酰胺转胺酶发酵培养基的优化

采用单因子试验和正交试验对链霉茵HS-1产谷氨酰胺转胺酶(TG)发酵培养基进行优化,以提高酶的产量.在所选用的无机氮源中,硫酸铵有利于茼体生长和产酶,硝酸钾和氯化铵不利于菌体生长和产酶;所选用的碳源中,甘油为最适碳源.通过L9(34)正交试验确定发酵培养基的组成为(g/L):豆饼粉,20;硫酸铵,3;甘油,20;酵母膏,6;MgSO4·7H2O,2;K2HPO4·3H2O,2.经过培养基优化,酶产量由6.42μ/mL提高到7.45μ/mL.     

微生物谷氨酰胺转胺酶对大豆分离蛋白凝胶性的影响

利用Streptoverticillium sp.CJ3033菌株发酵得到发酵液,经过滤、离心、冷冻浓缩、乙醇沉淀和冷冻干燥后,制得的谷氨酰胺转胺酶粗酶作用于大豆分离蛋白,利用物性分析仪研究了MTG对大豆分离蛋白形成凝胶的特性及持水性的作用.通过二次回归正交组合设计的方法研究了MTG的添加浓度、作用时间、处理温度对SPI凝胶形成及保水性的影响,结果显示:MTGase对大豆分离蛋白有显著改善作用,在51℃、反应1.5 h、酶浓度9.82 U/g时,SPI的凝胶强度最大,达74.95 g/mm2;在49℃、反应1.3 h、酶浓度7.78 U/g时,SPI的持水率为96.47%.     

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

以野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得带有SD序列及谷氨酸棒状杆菌信号肽ΔS0949的BTG基因.将其与大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接,构建重组质粒pXMJ19-Sbtg转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032.经IPTG诱导后该重组菌发酵液具有交联酪蛋白的能力,表明该重组菌能够实现分泌表达.     

炎症因子在组织纤维化中介导组织型转谷氨酰胺酶的表达

本研究在肝硬化病人的标本中,发现tTG和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,alpha-SMA)共位表达,表明tTG与肝星状细胞(hepatic stellate cells)的激活/转分化有关,与肝硬化的程度相关.烧伤病人的增生性瘢痕皮肤中tTG含量也相对于正常皮肤增加明显,并且分布于细胞外胶原蛋白之中,于alpha-SMA阳性细胞的周围.经体外星状细胞实验,白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)能够诱导肝星状细胞在蛋白水平和mRNA水平表达tTG.同样,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)也能诱导表皮细胞(Hacat)表达tTG.表明,在组织损伤过程中,炎症反应可能引发细胞外基质的交联,促进纤维化.     

偶联酶法检验L-天冬酰胺酶的动力学分析

根据McClure偶联酶反应理论,通过实验对偶联酶法检验L-天冬酰胺酶活力的反应条件进行了动力学分析,确定了合理的附加酶用量,建立了偶联酶法检验此酶活力程序。用该程序测定的底物K_m值和产物的抑制常数K_1值与文献值相符。     

TGase对海地瓜胶原蛋白凝胶强度的影响

为了研究海地瓜胶原蛋白的凝胶特性,提高其凝胶强度,探讨了谷氨酰胺转氨酶(TGase)对海地瓜胶原蛋白凝胶特性的影响,在单因素的基础上采用响应面设计对影响凝胶特性的3个显著因素（TGase添加量、作用时间、作用温度）进行优化.结果显示:单因素实验时,海地瓜胶原蛋白的凝胶强度在TGase添加量18.0 U/g、作用时间5.0 h、作用温度40.0 ℃时达到最大;通过响应面优化,得到海地瓜胶原蛋白凝胶强度在TGase添加量18.00 U/g、作用时间5.13 h和作用温度40.30 ℃时达到最大,为6473.98 g·mm,是未优化前凝胶强度5511.50 g·mm的1.17倍,是未添加TGase前凝胶强度1118.88 g·mm的5.79倍,即TGase能够促进蛋白质之间的交联作用,显著提高海地瓜胶原蛋白凝胶强度.经过验证性试验,得到该条件下海地瓜胶原蛋白凝胶强度为6428.36 g·mm,与理论值相比,误差仅为0.70%.