俄罗斯拟松材线虫的致病性

调查表明在俄罗斯目前尚未发现松材线虫的分布,但是有松材线虫的近缘种拟松材线虫的分布。在温室中利用从俄罗斯远东地区天然病死树上分离到拟松材线虫BmRFE,其分离物的接种实验表明,BmRFE分离物可使5年生Pinus koraiensis和Larix olgensis全部死亡,而70 %的P.sylvestris和P.densiflora可存活下来。室外试验的结果表明,用3种拟松材线虫分离物接种黑松,1 a之后只有BmRFE接种的2年生黑松中的线虫存活下来。在第2次试验的南方利用B.mucronatus(BmKOMY)和法国拟松材线虫分离物(BmFr),及两者杂交种分离物接种4年生P.sylvestris,结果表明接种后1 a几乎所有分离物均存活下来了,但是只有接种BmFr的松树表现出病害症状。病状的严重程度与拟松材线虫携带的致病细菌的毒性有关。毒性生测证明拟松材线虫BmRFE分离物携带了致病性最强的细菌。     

松材线虫携带的细菌的寄生性和致病性研究

用荧光方法观察了松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）携带的细菌对悬浮培养的黑松（Pinus thunbergii）细胞的毒性,表明其中的假单胞菌、荧光假单胞菌和少动鞘氨醇单胞菌的滤液对黑松细胞具有较强的毒性,这与松树发病早期出现的细菌种类一致;这些细菌在添加松树提取液的细菌培养基上不能生长或基本不能生长,表明松树体内可能存在某些不利于细菌生长的物质;同时,单独接种这些细菌不能感染健康的黑松,因此,在线虫最初进入树体中,细菌的生长与线虫密切相关．     

松材线虫携带细菌的鉴定和毒性研究

从松材线虫病致死的松材木质部和松材线虫体表分离到3个出现频率较高的细菌菌株，菌株Nji、Njt和Njw。经鉴定3种细菌分别为荧光假单胞菌I型（Pseudomonas fluorescens biotype I)荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biotype Ⅱ）和泛菌属某种（Pantoea sp.)。用牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡培养细菌，培养液直接处理黑松愈伤组织，测定各细菌的产毒能力。与对照（空白培养液）相比，3种细菌的培养原液都可对黑松愈伤组织产生明显影响，其中菌株Nih和菌株Njt可以在2d内使愈伤组织明显变色，菌株Njw处理变色较慢。表明菌株Nij和Njt培养液内有大量致萎毒性物质存在。     

松材线虫携带细菌部位的电镜观察

对活体松材线虫样品进行处理,用透射电镜对松材线虫各部分进行切片和详细观察,未能在线虫体内的任何部位观察到细菌。然而,用较少脱水步骤的扫描电镜样品处理方法处理活体松材线虫,用扫描电镜在线虫体表观察到了许多细菌这些细菌形态一致、杆状、长１．４８～１．７３ｕｍ、直径０．４９～０．６２ｕｍ。本是关于松材线虫携带细菌部位的首次报道。     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

松材线虫体表物质与其携带细菌的关系

松萎蔫病是由松材线虫与其所携带的细菌复合侵染所引起。为进一步明确松材线虫与其携带细菌的关系,笔者用无菌线虫体表浸泡物处理细菌,再将无菌线虫各虫株与细菌共培养,结果表明细菌的存在可促进线虫的繁殖,线虫体表浸泡物质可促进细菌繁殖,无菌线虫与细菌共培养后线虫繁殖数量较无菌线虫单独培养有明显增加,说明松材线虫与其体表细菌的关系为一种互惠关系。此外还设计了无菌线虫对细菌的趋向性试验,考察线虫与自身体表所携带细菌之间的趋向性是否具有特异性,结果表明所有无菌线虫对成团泛菌具有明显的趋向性,各无菌松材线虫对于分离自各自体表的细菌菌株没有特异的趋向性。     

松材线虫携带细菌数量的测定及无菌松材线虫的培养

对来源于自然条件和常规培养条件下的松材线虫携带的细菌数量进行了测定 ,并采用黑松愈伤组织对松材线虫进行了纯培养。结果表明 ,自然感病的黑松病组织中的松材线虫携带活细菌的数量平均为 2 .9× 10 2 个 条 ,灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为 3.0× 10 3 个 条 ;来源于自然感病的黑松和马尾松上的松材线虫 ,经无菌处理后 ,在黑松愈伤组织上生长良好 ,用 3g新鲜愈伤组织培养 9d ,虫口数量可达 10万余条。     

松材线虫和拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究

目前松材线虫的致病机理尚不明确,其食道腺可能在致病过程中起重要作用。文章介绍了松材线虫的寄生方式及其致病机理,并对松材线虫与拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究进行了文献的整理和分析。     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18 OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。     

抗生素对松材线虫携带菌的制菌效应研究

对从长岛松材线虫体表分离的3株携带菌株即中间肠杆菌(Esherichia intermedium)、鲁氏不动杆菌(Acinnetobacter lwoffi)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),选用分属于6大类的8种抗生素进行了抗生素药敏定性试验,初选出5种有效抗生素,采用对倍稀释法进行进一步定量试验,确定了抗生素的最小抑菌浓度(MIC).结果表明,阿奇霉素、阿米卡星和诺氟沙星对单一菌种及混菌作用明显,有效浓度范围宽,这可为获得无菌松材线虫提供参考依据.     

松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。     

不同线虫在黑松体内的扩展速度与致病性

分别用强、弱致病力松材线虫和无致病力拟松材线虫接种2年生黑松苗.观察结果表明:强致病力松材线虫在黑松体内扩散速度较快,4 d针叶开始发黄,7d松苗新梢开始萎蔫下垂,10 d松苗萎蔫,线虫在松苗体内大量繁殖,超过接种时的线虫数;弱致病力松材线虫在黑松体内扩散速度较慢,7 d针叶出现发黄的迹象,15 d新梢开始蒌蔫,25 d松苗整株萎蔫,线虫数量开始增加,超过接种时的线虫数;无致病力拟松材线虫接种后7 d仅在树梢分离到少量线虫,梢部部分针叶发黄,之后线虫基本未繁殖,25 d松苗体内已分离不到线虫,梢部针叶症状未加剧,松苗生长与对照类似.因此,黑松感染线虫后,是否发病与线虫能否在松苗体内存活有关,发病速度快慢与线虫在松苗体内扩散速度及能否大量繁殖有直接关系.     

松材线虫行为学研究进展

对松材线虫的侵入、松材线虫在树体内的运动与迁移、取食和繁殖等方面的行为学研究进展进行综述。松材线虫侵入寄主体内主要是随着松天牛取食进行的；而类脂含量降低后，松材线虫具有脱离松天牛而进入寄主的特性；挥发性物质尤其是β-香叶烯在松材线虫进入树体内起重要作用。温度、湿度、不饱和脂肪酸、树脂道、寄主生理状况等均影响到松材线虫的运动与迁移。松材线虫侵入树体后，大多滞留在树脂道，蜕皮变为成虫后再向其它部位迁移。蛹室中天牛释放的化学物质可吸引松材线早向蛹室迁移。松材线早在树体内主要以薄壁细胞为食，病树枯死后则以真菌等为食。温度和水分是影响松材线早繁殖行为的主要外界因子。松材线早的性引诱方式为相互引诱，但性信息素的化学特性尚等继续研究。     

不同致病力线虫接种黑松后寄主体内组织病理学变化

分别用强、弱致病力松材线虫和无致病力拟松材线虫接种2年生黑松苗,发现不同致病力线虫在黑松苗体内的迁移特性不同,导致黑松苗产生的组织病理学变化也有差异.强致病力松材线虫扩散主要通过轴向树脂道在树体内上下扩散,通过径向树脂道在树体内向外扩散,并以此成为逾越形成层的通道,由于松属植物树脂道是遍布整个树体的一个"管网系统",所以线虫扩散速度快;弱致病力松材线虫扩散主要在皮层中,扩散速度慢,致病速度慢;无致病力拟松材线虫主要分布在皮层中,仅仅在少数皮层树脂道中发现线虫,而其对韧皮部、维管形成层细胞、木质部的射线细胞和树脂道周围的薄壁细胞未造成影响,也不能大量繁殖,因而对黑松不致病.无论是强致病力松材线虫还是弱致病力松材线虫接种后均未观察到线虫直接侵入松树形成层细胞,形成层细胞的死亡是一个渐进的过程,与线虫未到达的树脂道上皮细胞等薄壁细胞的死亡方式类似.     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。