PC12细胞诱导的神经缺血细胞Smad7-siRNA及沉默效果的检测

目的探讨诱导PC12细胞分化的神经细胞靶向沉默Smad7基因特性,同时进行沉默效果检测.方法以Smad7基因为靶目标,设计合成3条siRNA序列,进行细胞转染,利用Real time-PCR和Western blot技术检测沉默效果,筛选出最有效的干扰序列,同时检测出最佳的转染浓度和转染时间.结果针对Smad7基因设计合成及筛选出靶向沉默Smad7基因的干扰序列(siRNA1);siRNA1的最佳转染浓度是4μg/mL;siRNA1的最佳转染时间是24 h;siRNA1对Smad7的抑制效果优于其他干扰序列.结论 siRNA1能有效沉默Smad7基因;lipofectamineTM2000可成功将siRNA1转染至神经细胞,转染效率较高;利用siRNA技术能有效抑制神经细胞.     

靶向肿瘤多药耐药基因mdr1的siRNA的构建与鉴定

mdr 1基因及其表达产物P-gp是引起肿瘤细胞多药耐药(MDR)的主要原因,抑制mdr 1基因的表达可用于逆转MDR.RNAi可用于特异抑制靶基因的表达,本研究的目的是构建获得可特异有效靶向mdr 1基因的siRNA元件.应用siRNA设计软件与mRNA结构分析软件设计构建了3个分别靶向mdr 1基因mRNA环结构和茎结构的siRNA元件,同时构建了携带mdr1基因序列的luc报告质粒,通过siRNA表达质粒与携带靶序列的报告质粒的共转染抑制实验检测不同siRNA的抑制效率,结果显示靶向环结构siMDR1B具有较好的抑制效率和特异性.进一步将siMDR1B表达载体与mdr1基因表达载体共转染细胞,应用免疫流式细胞术检测显示,相比对照细胞,siMDR1B可显著抑制其转染后mdr1基因产物P-gp蛋白的表达活性.同时采用CCK-8细胞活性检测试剂评价了siMDR1B对细胞活性的影响,结果显示siMDR1B不会影响细胞活性,具有良好的特异性.本研究获得的可有效靶向mdr 1基因的siRNA元件可为进一步开展逆转MDR研究提供重要基础.     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

具有较高基因沉默效应的siRNA设计

详细说明了如何通过对特定基因mRNA序列进行分析设计具有较高基因沉默效应的siRNA方法,并应用该方法针对小鼠早幼粒细胞白血病基因pml3设计相应的siRNA.通过RT-PCR和Western Blot的方法,验证了其对pml3基因表达的抑制效果,实验证明通过我们提出的方法所设计的siRNA具有较高的基因沉默效应.     

大鼠CRMP1基因siRNA的筛选

目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时 PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从而筛选抑制效率最高的siRNA.结果:流式细胞仪检测转染效率为52.5%.通过RT-PCR的初步检测和实时 PCR的定量检测结果显示,与对照组相比,所设计的3对siRNA均能不同程度抑制CRMP1基因mRNA的表达,其中CRMP1-249 siRNA抑制效果最佳,抑制率达84.3%.结论:成功筛选出1对能有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.     

具有较高基因沉默效应的siRNA设计

详细说明了如何通过对特定基因mRNA序列进行分析设计具有较高基因沉默效应的siRNA方法．并应用该方法针对小鼠早幼粒细胞自血病基因pml3设计相应的siRNA．通过RT—PCR和Western Blot的方法．验证了其对pml3基因表达的抑制效果，实验证明通过我们提出的方法所设计的siRNA具有较高的基因沉默效应．     

siRNA分子设计研究进展

为了设计高效的siRNA（Short interfering Ribonucleic Acid）分子、最大限度地减少siRNA分子的脱靶效应（off-target effects），siRNA分子设计已经成为热门研究领域。siRNA分子设计主要是基于序列和能量特征，以及靶标的二级结构特征，基于这些特征设计的siRNA分子已经有了较高的抑制基因表达的效率。RNAi（RNA interference）在
基因发现以及疾病治疗领域已有非常广泛的应用，就siRNA分子设计近年的研究进展作一综述，为今后siRNA研究提供参考。     

靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装验证

为了解决靶向TTF-1的siRNA导入肺腺癌细胞的问题,设计了3条靶向NCI-H1975细胞TTF-1基因的siRNA,并将其分别构建到腺相关病毒上.在293细胞中装配病毒,收获病毒原初液后进行超滤浓缩、层析柱纯化,测定病毒滴度.重组病毒感染肺腺癌细胞系NCI-H1975,通过Western-Blot实验检测siRNA效果,利用凋亡实验验证细胞生物学效应.Western-Blot实验测得siRNA有较好的干扰效果,凋亡实验测得肺腺癌细胞NCI-H1975产生了凋亡,从而证明具有感染性的靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装成功.     

siRNA干扰Survivin基因对结肠癌生物学特性影响

向结肠癌SW480细胞中导入针对Survivin基因的siRNA,研究RNA干扰对SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据,同时寻求新的、有效的RNA干扰片段.设计3条特异性干扰靶向Survivin基因的siRNA,转染24,48,72h后,Western蛋白印迹法检测Survivin蛋白变化,同时噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.3条siRNA分别作用于SW480细胞,转染24,48,72h后,3组Survivin蛋白表达均出现下调(P<0.05),在48h时达到顶峰,抑制率分别为66.5%±2.1%,49.6%±2.8%和47.8%±3.1%,差异具有统计学意义(P<0.05);MTT法显示Survivin基因沉默后,细胞增殖受到明显抑制.脂质体所介导的体外Survivin siRNA,能有效地沉默结肠癌细胞的Survivin基因,从而抑制结肠癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡,特别是针对保守区域设计的靶向siRNA.干扰效果更为显著.     

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞药物泵P-gp及LRP蛋白表达的影响

目的:用补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,观测药物泵P-gp及LRP的表达,并同小干扰RNA片段(siRNA)靶向切除P-gp、LRP基因后对这两种蛋白表达的影响相比较.方法:补中益气汤含药血清处理A549/DDP细胞,设计并合成针对P-gp、LRP基因对应序列的siRNA,采用转染试剂对细胞进行转染.两种蛋白实验分组均为:空白对照组、含药血清处理组及siRNA处理组.采用RT-PCR检测P-gp及LRP mRNA,免疫细胞化学法检测蛋白表达及定位,WB检测蛋白表达.结果:补中益气汤含药血清可以降低两种药物泵的表达,效果同siRNA类似,具有统计学差异(P0.05).结论:补中益气汤含药血清能降低A549/DDP细胞上P-gp和LRP的表达.     

CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

布鲁菌感染细胞NF-κB的表达水平检测及其干扰方法研究

目的本文针对布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中NF-κB的表达进行检测,并比较siRNA和shRNA对RAW264.7细胞中NF-κB表达沉默效果。方法根据NF-κB P65基因序列,设计siRNA干扰序列,通过干扰RAW264.7细胞筛选效率较高的siRNA设计shRNA序列,siRNA和shRNA同时干扰布鲁氏菌侵染的RAW264.7细胞,使用RT-PCR方法检测NF-κB P65基因的相对表达情况。结果与阴性对照mock组相比,P65-shRNA组表达降低;P65-siRNA组P65表达低于P65-shRNA组,均低于阴性对照mock组;布鲁氏菌侵染组,P65表达显著高于阴性对照组。结论布鲁氏菌侵染组促进了NF-κB P65的表达,P65-shRNA、P65-siRNA组均抑制了NF-κB P65的表达,siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,在RNA干扰的应用中可与shRNA配合使用。     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接，构建CREPT基因敲除质粒；体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体；体外切割实验结果显示，以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

siRNA序列特征的RNA干扰效率预测的新方法

为了快速、准确预测siRNA(Small interfering Ribonucleic Acid)的干扰效率,通过对2431条siRNA的统计学分析找到了一个可靠的预测新方法.通过统计学方法从众多特征中筛选出了19个与siRNA抑制效率相关的序列特征,并用这些特征给出了siRNA抑制效率水平的聚类方法,准确率达到81...     

靶向HIV-1细胞受体基因CCR5的人工miRNA的构建与鉴定

趋化因子CCR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,通过抑制CCR5的表达可以在一定程度上阻断HIV-1的复制进程.miRNA介导的RNA干扰相比经典的siRNA在应用中具有更多的特点.本研究的目的是构建可特异有效靶向CCR5的人工miRNA元件.本研究以CCR5基因序列为模板设计了14个miRNA靶序列,以天然miR-30a为基础骨架通过靶序列区替换构建人工miRNA元件.通过将miRNA表达质粒与携带靶序列区的报告质粒的共转染抑制实验检测不同miRNA的抑制效率,结果显示miCCR-13A具有较好的抑制效率和特异性.进一步将miCCR-13A表达载体转染CCR5阳性的HIV-1受体细胞株TZM-b1,RT-PCR检测显示miCCR-13A可在细胞中获得有效表达,同时应用免疫流式细胞术检测显示在miCCR-13A转染细胞相比对照细胞的CCR5蛋白的检测活性明显降低.进一步的研究显示miCCR-13A在细胞中不会影响细胞活性和干扰素效应相关基因osa1和stat1 mRNA水平,具有良好的特异性.本研究获得的可特异靶向CCR5的人工miRNA元件可为进一步的抗HIV-1研究提供重要基础.     

DNA核靶向序列的研究进展

DNA核靶向序列(DNA nuclear targeting sequence,DTS)是指能够促进外源质粒DNA通过核孔复合体(Nuclear Pore Complex,NPC)靶向入核的DNA片段。筛选和发现有活性的DTS,并将其插入质粒载体中,对于在不分裂细胞中采用非病毒介导的基因转移方法所开展的基因治疗的效率的提高,具有重要科学意义。该文综述了DNA核靶向序列的发现及其作用机制,并展望了其应用前景。     

CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选

为构建靶向T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,基于p X458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒,将其转染Hep G2细胞系,用流式细胞术检测转染效率;转染48 h后提取Hep G2细胞基因组DNA,扩增含有编辑位点的片段,测序分析该片段的峰图改变;对出现双峰的扩增片段做T-A克隆后测序分析,确定基因编辑发生的位置,并结合转染效率计算基因编辑效率.结果表明,成功构建含有3种sgRNA序列(N1、N2、S1)的p X458-sgRNA质粒,其转染效率分别为38.5%(N1)、39.7%(N2)和24.2%(S1);基因组PCR产物测序分析发现,S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰;T-A克隆测序发现,20克隆有4个发生了基因编辑(20%),结合转染效率(24.2%)可知,编辑效率约为83%.可见,本文成功构建靶向TCR基因的CRISPR-CassgRNA质粒,并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列.     

基于BLOCK-iTTM的RNA干扰序列设计与PCR验证

RNA干扰(RNAi)是经典的基因表达下调工具,多数实验室将RNAi的序列设计工作委托公司完成。本研究以BAIAP2L1和DDIAS基因为例,选择ThermoFisher公司的BLOCK-iTTMRNAi Designer设计工具自行设计siRNA序列,并通过实时荧光定量PCR检测基因表达水平,验证干扰效果。结果显示基因表达水平下调能够达到70%以上,实现良好的RNAi效果,表明通过BLOCK-iTTMRNAi Designer自行设计获得的siRNA序列能够满足预期的基因表达下调。     

RNAi技术研究进展

RNAi是由双链RNA引起的基因沉默现象，它通过降解具有同源序列的mRNA起作用，特殊设计的siRNA能使目的基因发生特异性沉默．目前，获得siRNA已经非常方便，导入方式最常用的是微注射．RNAi技术有编码区RNAi和启动子区RNAi两大类，均可以产生类似基因敲除的功能。在家蚕功能基因的研究中已经使用了这种方法．随着RNAi技术的不断进步，RNAi可广泛地应用到功能基因组学，药物靶点筛选，疾病治疗等方面．