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腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对大鼠心肌缺血的基因治疗 总被引:13,自引:1,他引:13
为研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子对心肌缺血基因治疗的可行性,首先用RT—PCR方法从人胎盘cDNA文库中克隆人肝细胞生长因子(HGF)基因全长编码区cDNA,通过脂质体共转染和细胞内质粒同源重组的方法构建了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad—HGF.经过在293细胞系内的扩增和氯化铯密度梯度离心获得大量纯化的重组腺病毒、体外实验中用ELISA方法证明肝细胞生长因子能在原代培养的乳大鼠心肌细胞中表达并分泌到培养上清液中、然后用MTT方法测定了其对内皮细胞的刺激增殖作用、活体实验中用绿色荧光蛋白基因作为报告基因检测了腺病毒在大鼠体内的分布和表达持续时间,通过大鼠冠状动脉结扎后制作的心肌缺血动物模型,证明重组腺病毒Ad—HGF对大鼠,心肌缺血的治疗是有效的。以上结果说明Ad—HGF的构建是成功的,在体内外都显示了其生物学活性、为基因治疗缺血性心脏病提供了实验依据. 相似文献
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将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础. 相似文献
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携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究 总被引:1,自引:0,他引:1
构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因(hⅨR338A)及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的rAAV/HSV杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 1.25 × 1012病毒颗粒/mL,然后,利用这一重组病毒,对rhFⅨR338A进行离体及在体表达, 获得了 rhFⅨR338A在肌细胞系 C2C12及血友病 B小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达(2551.32± 92.14)ng·(106细胞)-1·(24h)-1及463.28ng·mL-1,与野生型Ⅸ因子的表达水平(2565.76±64.36)ng· (106细胞)-1·(24 h)-1及453.92 ng· mL-1无显著性差异.然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 2.46倍..将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 B基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──rAAV/HSV杂合病毒包装系统──在重组AAV载体大量制备中的应用 相似文献