家蚕浓核病毒BmDNV-1(伊那株)结构蛋白基因VP4的克隆、表达及抗体制备

为研发新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)疫苗候选抗原基因,为血吸虫诊断和疫苗研制提供依据,提取和纯化S.japonicum成虫DNA,PCR扩增相关基因,然后将其克隆入pBST载体,对菌落PCR阳性克隆子测序和分析.菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,PCR产物与S.japonicum 22 600抗原分子DNA序列具有高度同源性,636 bp大小,oRF189 bp,ORF小是全长的蒯读框,只获得部分编码区,能编码63个氨基酸,表达产物含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).本研究所获取的阳性克隆是与S.japonicum 22 600抗原编码基因有高度同源性的基因.通过Blastn和BLASTP分析,预测该基因为体膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体壁相关蛋白,可能是信号传递分子.     

成都地区60株铜绿假单胞菌中第I类整合子的鉴定及特性分析

采用两种PCR法(整合酶PCR法和长片段整合子PCR法)检测60株成都地区4家医院分离的铜绿假单胞菌的第Ⅰ类整合子,并对扩增产物进行序列分析.对60株铜绿假单胞菌第Ⅰ类整合酶基因的检测,发现有28株扩增结果为阳性(46.7%),所扩增片段的大小为110 bp.测序结果与GenBank中已报道的ⅠntI1基因核酸序列同源性为100%.长片段PCR法扩增Ⅰ类整合子的可变区,60株铜绿假单胞菌中有18株检测到不同大小的Ⅰ类整合子基因盒,占标本总数的30.0%.插入的基因盒大小从300 bp到超过2000 bp不等,18株整合子阳性菌中,有两株菌同时含有2种大小不同的整合子.序列分析结果表明,菌株R03的1900 bp 整合子携带aacA4基因盒,菌株W13的1900 bp整合子中含dfr17和aadA5基因盒.     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

藏羚羊(AAC)_n微卫星富集文库构建与引物筛选

基于磁珠富集法,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AAC)8从藏羚羊(Tibetan antelope)基因组酶切的300~1000bp片段中筛选微卫星位点,纯化的富集片段连接到pCR@2.1载体和转化到Trans5α感受态细胞.随机挑取180个白斑克隆,PCR检测到条带数大于或等于2的阳性克隆为56个,阳性率为31.1%.对阳性克隆测序,获得43条含微卫星座位的序列,微卫星重复次数在5~20次之间.舍弃不适宜设计引物的微卫星座位,试验设计并合成了20对微卫星引物;以3个样点(青海、新疆、西藏)的24个藏羚羊基因组为模板进行PCR扩增,获得8对可得到稳定扩增产物的微卫星引物,其中4对引物的扩增产物具有多态性,座位分别为AAC050、AAC056、AAC165和AAC477.上述引物可用于藏羚羊及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等研究.     

血吸虫膜相关抗原基因的克隆

目的:筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)新的疫苗候选抗原基因.方法:以S.japonicum成虫DNA为模板,PCR扩增相关基因,然后将其克隆XpBS-T载体,通过菌落PCR对产物进行检测,对阳性克隆子测序,与GeneBank中的已知相关序列进行比对分析.结果:菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明PCR产物与S.japonicum 22.6 kDa抗原分子核苷酸序列具有高度同源性.其目的基因大小636 bp,具有一个189 bp的ORF,能编码63个氨基酸.ORF不是全长的阅读框,只获得部分编码区.表达产物可含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).讨论:成功克隆出一个与S.japonicum 22.6kDa抗原编码基因有高度同源性的基因.预测该基因为膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体表膜相关蛋白.在生理机能上,该膜相关蛋白可能是信号传递分子.     

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到puCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%.确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.     

侵染新疆辣椒CMV的外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现黄化的辣椒病株上获得分离物XJ-P,用1对CMV基因引物进行RT-PCR,扩增得到了774bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物克隆到pMD18-T载体中再转化到大肠杆菌TOP10。经限制性内切酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR产物大小相同的774bp的插入片段。cDNA全序列分析表明,所扩增出的774bpCMV基因,含1个657bp开放阅读框架（ORF）,编码218个氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的CMVCP基因。所测得的XJ-P分离物其CP基因与CMV亚组Ⅰ、亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源性分别为90.84%-94.22%和74.37%-76.52%,氨基酸同源性分别为94.04%-98.17%和80.37%-82.19%,因此将该分离物鉴定为黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ。     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.     

南方菟丝子18S rRNA基因片段的克隆与序列分析

根据拟南芥光敏色素B基因序列设计引物, RT-PCR扩增南方菟丝子同一基因相应片段, 扩增使用了TD PCR技术,同时获得3个特异基因片段,对长约300 bp的片段克隆后进行序列分析,显示该片段与沼泽菟丝子和拟南芥18S rRNA基因相应片段的一致性分别为98.9%和97%,结果表明,该片段为南方菟丝子18S rRNA基因片段.     

棉花转化酶基因保守片段的克隆及其序列分析

通过CODEHOP designer对已登陆GENEBANK的植物酸性转化酶基因序列的同源性分析,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计简并引物,以棉花总RNA为模板,通过RT-PCR方法得到cDNA,以此为模板通过PCR扩增得到片段长为1155bp的片段,将其克隆到加T载体上,经PCR和酶切鉴定筛选得到阳性克隆,并将阳性克隆进行测序,然后在GENBANK中进行blast检索。结果表明本研究克隆的棉花酸性转化酶基因片段编码的氨基酸与甜橙(BAF34362)、温州蜜桔(BAB82419)和梨(BAF35859)的液泡酸性转化酶基因编码的氨基酸的同源性分别为75%、75%和73%。因此,推测获得的基因片段定位于液泡。     

Construction of single-chromosome DNA library fromLilium regale Wilson

A protocol of simple rapid microdissection of single-chromosome, amplification and cloning of its DNA fromLilium regale Wilson is described. Single-chromosome, microdissected by micromanipulator, was put into a 0.5 mL Eppendorf tube and digested with Sau3A, and then the Sau3A linker adaptors were ligated to the ends of DNA fragments. After 2 rounds of PCR amplification with one chain of linker adaptor as primer, the PCR products thus obtained have a length of 300–2500 base pairs (bp) with predominant fragments at about 1000 bp. Southern blot analysis confirmed that the PCR products originated from the genome ofLilium regale Wilson. By cloning the amplification products from the second round of PCR, single-chromosome DNA library was constructed, in which about as many as 100000 recombinant clones were produced. A total number of 84 clones were analysed, and it was revealed that the inserts ranged in size from 300 to 1800 bp, with an average of780 bp. Compared with the methods described in other literature, this protocol, eliminating the need for enzymatic digestion and ligating micromanipulation of chromosomal DNA in nanoliter volumes, permits the efficient amplification of single chromosome (not tens of chromosomes as reported before) and the fragments (780 bp in average) cloned in this study are longer than those reported before (650 bp in average).     

Promoter activities of genes cpcT2 and cpcS2 in Nostoc PCC 7120

To study the promoter activities of genes cpcT 2 and cpcS 2,several upstream DNA fragments of these two genes with different lengths were selected.These fragments were fused with promoterless gfp(reporter gene) for constructing five recombinant plasmids.Then,these recombinant plasmids were transferred into Nostoc PCC 7120 by conjugation.The promoter activities of genes cpcT 2 and cpcS 2 were determined by observing the fluorescence of green fluorescent protein(GFP) with a fluorescence microscope.The result showed that the 1 300 bp(-1 300 to 0 bp) and 2 600 bp(-2 600 to 0 bp) upstream fragments of cpcT 2 had strong promoter activity and the promoter activity of the 680 bp(-680 to 0 bp) fragment was weaker than that of two above fragments of cpcT 2.The 2 000 bp(-2 000 to 0 bp) upstream fragment of cpcS 2 revealed weak promoter activity.This showed that a strong promoter of cpcT 2 was located in the upstream fragment between-680 and-1 300 bp.     

锯缘青蟹精氨酸激酶基因的克隆与表达

通过分子生物学方法,克隆得到锯缘青蟹（Scylla serrata）精氨酸激酶（Arginine Kinase,AK）开放阅读框基因序列.测序结果显示：该开放阅读框基因的序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸残基;该序列登录Genbank（GQ：851626）,序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶与凡纳滨对虾（...     

中国明对虾与5种虾类线粒体16S rRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究

采用PCR扩增和序列测定等技术,对中国明对虾（Fennerpenaeus chinem如）线粒体DNA16S rRNA和细胞色素氧化酶I（COI）基因片段进行了初步研究,分别得到16S rRNA和COI 2个基因片段的碱基序列,其中16S rRNA基因片段的大小为515bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为66．47％和33．53％;COI基因片段的大小为472bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为62．50％和37．29％．在2种基因片段中,AT的组成明显高于GC的组成,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的16S rRNA和COI基因片段的研究结果相似．通过对中国明对虾16S rRNA和COI 2个基因片段遗传特征的研究,16S rRNA只有8处核苷酸的碱基在4个群体间表现出差异,COI基因片段中共检测出24个多态性核苷酸位点,其种内变异较低。另外,将本研究所得序列与GenBank中对虾科5个种的16S rRNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类相一致．     

棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫（Helicoverpa armigera）组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bac、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测．结果：感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1700bp片段,SDS-PAGE、westem-blotcing检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性．     

离子交换-反相色谱法脱除胸腺肽α1盐离子

分两步脱除胸腺肽α1纯化过程中引入的盐离子.采用离子交换-反相色谱法脱除胸腺肽α1中的有机盐,再以反相液相色谱法除去无机盐,低温冷冻干燥最终获得胸腺肽α1产品,纯度为99.2%,收率为92.0%,含量为99.9%。结果表明,以离子交换-反相色谱法脱除有机盐,反相色谱法脱除无机盐,最终得到合格胸腺肽α1产品,为其他多肽的脱盐提供了新的思路.     

中国四个小型猪品种生长激素基因克隆测序及分子进化研究

研究对中国四个小型猪五指山猪、贵州香猪、滇南小耳猪和藏猪的生长激素基因(pGH,porcine growth hormone)进行了克隆测序及构建分子进化树,考察该激素对小型猪体型的影响。通过筛选合适的引物,采用PCR技术,扩增了四个小型猪品种的pGH基因全序列,并对其进行了克隆测序分析。4个小型猪品种pGH基因全长为2006bp,包括5个外显子和4个内含子,CDS全长为648bp。将4个品种小型猪和长白猪、雅南猪、内江猪进行了核苷酸序列比对,共有63处发生了变异,变异率为2.9%,其中外显子有12处变异,全部为转换;内含子有51处发生了变异,包括转换、颠换和缺失。聚类结果基本符合其地方猪种的地理位置分布原则。     

野山参与园参rDNA-ITS序列比较分析

目的比较野山参与园参rDNA-ITS序列差异,寻找其DNA分子鉴定方法.方法提取野山参与园参总DNA,扩增其ITS序列,运用Clustal X等软件比较分析野山参与园参ITS序列特征.结果野山参与园参经PCR扩增后分别获得700 bp和500 bp两条条带.其中对野山参和园参的700 bp条带测序分析后未发现差异位点,而二者的500 bp条带测序结果相似性仅为38%.结论该结果为野山参的鉴别提供了实验依据.