异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂结构的修饰

利用Fmoc固相多肽合成法, 按已知异柠檬酸裂解酶抑制剂的直链肽氨基酸序列合成首尾相连的环肽抑制剂. 经色谱纯化和质谱鉴定, 其相对分子质量的实测值与理论值相符. 抑制率实验结果表明, 合成的环肽对异柠檬酸裂解酶有明显抑制作用, 抑制率大于50%. 采用高效液相色谱法分别检测直链肽和环肽在血浆中的半衰期, 实验
结果表明, 环肽在血浆中的半衰期为11 min, 比直链肽的半衰期延长175%.     

中华鳖抗菌肽Hepcidin成熟肽基因的克隆及同源性的初步研究

采用同源克隆的方法,以用于扩增大菱鲆hepcidin成熟肽基因的引物,从中华鳖肝脏cDNA中扩增得到1条长78 bp的基因片段.初步判断其属于Hepcidin家族,与HAMP1具有较高的同源性,分析表明其为Hepcidin成熟肽.根据基因序列推断得到的成熟肽蛋白序列如下:QSHISLCRWCCNCCKANKGCGFCCKF.与其他物种的成熟肽进行比对,发现其与大菱鲆的成熟肽序列同源性达到100 %,并构建了基于各物种Hepcidin前体肽的系统发育树,为研究物种进化提供了证据.     

重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

南方水牛奶酪蛋白及大豆蛋白肽指纹图谱的差异性

通过LTQ Orbitrap XL组合型傅里叶变换高分辨质谱与反相高效液相色谱技术联用建立了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分肽质指纹图谱,并对其氨基酸组成与序列进行了比较.结果表明:酪蛋白经胰蛋白酶酶解后得到的28个肽段中没有检测到与酶解大豆分离蛋白181个肽段相匹配的肽段;酪蛋白(CN)的主要组分是αs1-CN、β-CN、κ-CN,大豆蛋白的主要组分为大豆球蛋白(包括大豆球蛋白G1~G5亚基)和β伴大豆球蛋白(α,α',β链);水牛奶酪蛋白和大豆蛋白在亚基组分的氨基酸数量、组成比例和排列方式均呈现出明显的差异,大豆蛋白的各组分亚基的氨基酸全序列均大于酪蛋白各组分的氨基酸全序列,且大豆蛋白各组分的分子质量均显著高于酪蛋白各组分.LTQ Orbitrap XL质谱技术对乳源蛋白肽质指纹的分析,为今后鉴定分析牛奶蛋白中是否添加廉价蛋白提供了高精度和高准确度的检测方法,也为复杂混合物中的痕量组分检测提供了理论依据.     

条斑紫菜ACEI肽结构鉴定与性能试验

对条斑紫菜蛋白酶解获得的血管紧张素转换酶抑制肽(ACEI)进行纯化和结构鉴定,并研究了条斑紫菜ACEI肽体外贮存稳定性和对原发性高血压大鼠的降血压作用.结果表明:通过2步反相高效液相制备色谱纯化得到2种单一组分ACEI肽,经液质联用质谱分析肽序列分别为Cys-Ser-Asn-Arg和Pro-Cys-His-Trp,二者对血管紧张素转换酶半数抑制浓度分别为24.71和5.38 μmol·L-1;条斑紫菜ACEI肽不耐高温,在中性或酸性条件下较稳定;用分子质量小于3 ku条斑紫菜ACEI肽组分对原发性高血压大鼠灌胃后有显著降血压效果,且降血压幅度随灌胃剂量增大而提高.     

利用十二肽库筛选心肌型脂肪酸结合蛋白特异性的亲和配体

采用噬菌体表面展示十二肽库对心肌型脂肪酸结合蛋白（H FABP）特异性亲和配体进行筛选, 经3轮筛选及序列比对后得到一个酶联免疫测定分析 (ELISA)检测阳性特征序列： W P N H H M L H K R W P. 对此序列进行肽合成, 并标记上荧光标记物芘, 经高效液相纯化、 冻干及质谱确定其分子量后制成荧光肽探针检测急性心肌梗塞病人血样, 结果均呈阳性. 结果表明, 所获得的肽探针具有较好的临床应用效果.心肌型脂肪酸结合蛋白; 噬菌体表面展示十二肽库; 亲和配体; 酶联免疫测定分析     

抗体亲和肽配基的高通量筛选和理性设计

抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白,在疾病治疗和检测方面应用前景广阔.目前抗体的分离纯化是其生产的瓶颈.高选择性的亲和色谱技术在抗体纯化过程中发挥着越来越重要的作用,而配基的高通量筛选和设计是亲和色谱技术应用的关键因素.短肽是一种常见的亲和配基类型.本文根据近年来国内外抗体亲和肽配基的研究情况,综述了抗体亲和肽配基的高通量筛选和理性设计方法,重点介绍其作用机理、发展现状以及目前存在的主要问题.最后展望了短肽配基仿生设计技术.     

鹿血抗氧化活性肽分子量测定及其氨基酸组成分析

分离提纯了鹿血酶解产物中的抗氧化活性肽,并用高效液相色谱(HPLC)体积排阻法(SEC)测定分子量,分析其氨基酸组成.经SephadexG-25和DEAE-52柱层析纯化,得到了带有较弱负电荷的抗氧化活性肽.HPLC分析结果表明,该抗氧化活性肽为低分子量肽类物质,且是以相对分子量为876,463,146Da为主的小肽混合物.氨基酸组成分析表明,该肽所含17种氨基酸中以亮氨酸、赖氨酸和丙氨酸的质量分数较高,分别为17.2%、12.3%和12.1%,人体必需氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸)的含量为52.7%.     

基于梯度提升决策树的肽碎片离子强度建模

为找到对蛋白质鉴定算法影响较大的肽碎片离子特征,以提高鉴定结果的正确率,在碎片离子特征与强度信息的基础上进行建模,构建预测模型.实验首先使用pFind对串联质谱数据鉴定,将鉴定结果过滤出需要的肽序列;然后计算出离子质荷比与离子特征值,通过匹配离子的质荷比获取离子强度信息;使用强度信息与离子特征值构建libsvm格式文件,使用XGBoost构建预测模型,其中使用了梯度提升决策树算法;最后使用构建完成的预测模型对蛋白质产生的肽序列做离子强度理论预测.实验结果表明模型所预测的肽序列离子强度与实验离子强度有着较高的相似度,同时分析预测模型可以从预测树中发现肽序列碎裂的规律,提取肽碎片离子中对强度值影响较大的离子特征.     

尿激酶短肽抑制剂的初步研究

以尿激酶为目标蛋白, 在噬菌体表面展示六肽库中对尿激酶的短肽类抑制剂进行了三轮特异性筛选. 提高噬菌体与尿激酶的比例及缩短作用时间从而提高筛选压力后, 与尿激酶亲和结合的噬菌体得到富集. 通过对第三轮筛选到的重组噬菌体的DNA序列分析, 获得一组相对保守的肽序列. 相应的合成短肽 NEPKAN 和VSPKVL 对尿激酶的抑制常数分别为32.5 μmol/L和88.6 μmol/L.     

融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白 原核表达及蛋白纯化

目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列,转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达,利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16. 5融合蛋白表达载体,并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化,研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0. 5 mmol、37℃条件下诱导4 h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础.     

噬菌体展示肽库技术淘选蚕丝纤维蛋白连结短肽的实验研究

采用噬菌体随机肽库展示技术研究与蚕丝纤维蛋白连结的功能性短肽的淘选方法.实验结果显示,淘选的与蚕丝纤维蛋白连结的功能性短肽都包含有一个相同的氨基酸残基序列QSWS.噬菌体与蚕丝蛋白的连结试验和合成肽与蚕丝蛋白的连结试验都证实了QSWS序列与蚕丝蛋白连结的重要性.随着对淘选方法进一步改进和优化,这些功能性短肽将有助于对蚕丝进行功能化改造,可拓宽蚕丝在生物材料领域中的应用.     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

广西巴马小型猪活化素β_A/β_B基因cDNA克隆与序列分析

目的通过克隆广西巴马小型猪活化素(activin)βA/βB基因cDNA,分析其序列,为研究活化素的生物学功能打下基础。方法提取广西巴马小型猪发情母猪的卵巢总RNA,并以其为模板,以下游特异性引物为反转录引物,在AMV酶作用下合成cDNA;用LA-Taq进行PCR扩增出包括成熟肽在内的activinβA及βB基因的部分序列,把两个序列分别连接到PMD-18载体进行克隆和序列分析。结果包括成熟肽在内的activinβA及βB基因的部分序列长度分别为964 bp和791 bp,两个亚基的序列比较保守,与GenBank上发表的猪activin两个亚基同源性达到99.79%和99.62%。activinβA基因有两个碱基发生突变,其中一个在成熟肽序列上,一个在非编码序列上;βB基因信号肽序列上有三个碱基发生突变,其中一个是同义突变。     

新麦26的α-醇溶蛋白基因克隆与序列分析

α-醇溶蛋白是小麦籽粒中含量最为丰富的蛋白，也是诱发乳糜泻综合症(celiac disease, CD)的主要活性蛋白.为了解优质强筋小麦新麦26(Triticum aestivum L.)的α-醇溶蛋白基因构成和诱发CD的毒性肽段，作者采用AS-PCR方法从新麦26中克隆了63个序列长度为846-942 bp的全长基因，其中30个序列为假基因，33个序列为功能基因，暂定名为XMGli2-1-XMGli2-33.上述基因可编码长度为285-316个氨基酸的蛋白序列，这些序列具有典型的α-醇溶蛋白特征.其中XMGli2-10、XMGli2-19、XMGli2-26、XMGli2-32和XMGli2-33的多聚谷氨酰胺II区还出现了1个额外的半胱氨酸残基，有助于参与形成链间二硫键，与小麦面筋品质呈正效应.在4类诱发CD的毒性肽段中，DQ2.5-glia-α1a的保守性更强，其他毒性肽段的序列变化较大.在XMGli2-20和XMGli2-28中还存在一个LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQ的肽段，具有较强的免疫毒性.     

少棘蜈蚣钾通道毒素多肽KTX-Ssm175的表达、纯化与鉴定

采用Illumina II代转录组测序技术构建了湖北少棘蜈蚣毒腺转录组数据库,从中筛选到一个全新的毒素多肽编码基因KTX-Ssm175.经序列比对显示KTX-Ssm175多肽与κ-SLPTX-Ssm1a高度同源,提示KTX-Ssm175多肽为一种新的电压门控性钾通道阻断剂.采用基因工程技术构建了p GEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表达载体,通过GST融合蛋白表达法对KTX-Ssm175多肽在大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达和分离纯化.MALDI-TOF-MS质谱测定显示纯化的KTX-Ssm175多肽分子量与理论值相吻合,说明成功实现了KTX-Ssm175多肽的基因工程制备,为深入研究其结构与功能提供了物质基础.     

一种与核黄素合酶α亚基具有结构相似性的板蓝根多肽的分离纯化与表征

利用离子交换色谱SP-5PW和疏水色谱POROS HP2从板蓝根鲜根水相抽提物中分离纯化多肽组分,并对其进行生化表征.获得一种达到电泳纯的多肽RIP2,其相对分子质量约为6.87 ku,等电点约为7.73,N端氨基酸序列依次为QIGEFATAPF.经数据库搜索比对,发现该多肽与核黄素合酶α亚基具有一定的同源性.细胞毒性实验表明该多肽具有一定抗病毒作用.     

利用噬菌体肽库筛选小肽免疫抑制剂

利用MT-2细胞系特异性表达白细胞介素2受体α(IL-2R α)在细胞表面,作为靶蛋白在噬菌体六肽库中筛选,经过4轮筛选得到能特异性结合IL-2R α的配体,挑选出与IL-2R α亲和性高的21个噬菌体克隆,经过DNA测序,得到3组肽序列,其中2组序列分别与白细胞介素2(IL-2)的N端17-24(LLLDLQMI)序列和C端114-121(IVEFLNRW)序列相似,另外一组与IL-2R β和γ有共同的保守序列(WSXWS)相似.因此推测这些筛选到的序列可能模拟IL-2与受体α相互作用的位点和IL-2R β,γ与α结合的位点.根据筛选结果,进一步合成了一个九肽AIVEFLNRW,以ConA诱导的淋巴细胞转化实验为模型,观察到这个肽在终浓度≥31.3μg/mL时抑制效果明显.     

神经生长因子基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

以人胎盘组织DNA为模板,经PCR扩增出包含信号肽,前肽和成熟肽部分的prepro-NGF序列,经序列分析后克隆至转移载体pFastBac1中得到pFastBac-NGF,再将其转化含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,发生转座作用后,得到含NGF基因的重组穿梭载体rBacmid-NGF,用纯化的rBacmi...     

液相色谱-质谱联用技术分析三氯氧磷辅助下丝氨酸和组氨酸的成肽产物

丝组二肽是目前为止发现的世界上最小的有切割活性的肽,探索合适的丝组二肽合成方法以便进一步研究丝组二肽对蛋白核酸的切割机理、作为酶活性中心的化学依据以及其它生物活性具有十分重要的意义.我们以三氯氧磷为肽的缩和试剂,研究了丝氨酸和组氨酸在其辅助下的成肽反应,并利用液相色谱 质谱联用技术对反应产物进行了分离和鉴定,发现丝氨酸和组氨酸与三氯氧磷的反应不仅产生了丝组、组丝二肽,还产生了组组、丝丝、环组组、环丝组二肽等产物.这一结果为几种小肽的合成提供了新的思路.