慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.     

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

基于Cre-LoxP系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建与鉴定

目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ires TK慢病毒载体为模板,用Spe I与Kpn I进行双酶切,去除TERT-ires TK片段,然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接,构建p LOX-MCS表达载体.同时,以p B513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro表达框(带有Bam HI及Kpn I酶切位点),然后与经过Bam HI及Kpn I双酶切的p LOX-MCS载体连接,进而构建p LOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称p LOX-CMV-E/P)载体.将p LOX-CMV-E/P载体与慢病毒包装载体p CMVR8.74及p MD2.G共转染293T细胞,包装病毒进行报告基因的功能分析.结果:菌落聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致,绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能.结论:成功构建了p LOX-MCS及p LOX-CMV-E/P慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统.     

慢病毒介导的HBV-X基因可调控表达小鼠模型的构建

理想动物模型的缺乏是乙型肝炎病毒(HBV)研究的一个重要障碍.本实验运用可调控慢病毒载体结合精子介导的方法构建体内乙型肝炎病毒X基因(HBV-X)可调控表达的转基因小鼠模型.首先构建了四环素调控的HBV-X基因可调控表达慢病毒颗粒,再对雄性小鼠进行睾丸注射,后与母鼠合笼,母鼠分娩获得子代小鼠,最后利用Southern blot,反向PCR,Western blot以及免疫组织化学等方法分别对子代小鼠体内病毒基因整合情况和可控诱导表达情况进行检测.结果提示子代小鼠体内成功整合HBV-X基因,并在强力霉素(Dox)诱导后,可表达目的蛋白,可调控转基因小鼠构建基本成功.     

牙髓干细胞在修复牙槽骨缺损的组织学观察

为探索牙髓干细胞(DPSCs)在兔牙槽骨缺损再生修复中的成骨效果,为临床上骨缺损的修复提供一定的理论基础。采用从新西兰幼兔前牙及磨牙牙髓组织中分离DPSCs进行体外培养;16只实验新西兰兔随机分为空白组,实验组两组,在动物下颌无牙区牙槽骨人工制备10 mm×4 mm×4 mm骨缺损,其中空白组骨缺损区填入浸有PBS溶液的0.25 g Bio-oss骨粉,实验组加入1×108/L的DPSCs和0.25 g Bio-oss骨粉;于术后第6周同期处死动物,无菌获取牙槽骨组织,制作石蜡切片,HE染色及免疫组化检测骨涎蛋白(BSP)。结果显示:光镜下传代培养的细胞与原代培养的细胞形态基本一样,幼兔牙髓细胞具有体外多次传代增殖能力;术后6周,空白组纤维结缔组织较稀疏,牙槽嵴塌陷,唇舌侧牙槽骨凹陷吸收,HE染色可见少量红细胞,未见明显新骨生成,骨涎蛋白免疫组化成弱阳性表现。实验组牙槽骨缺损区愈合良好,牙槽嵴饱满,可见部分未吸收骨粉颗粒,被新生组织包裹,新生组织与骨缺损周围嵌入良好,上附有部分纤维结缔组织,唇舌侧牙槽骨未见明显凹陷,大部分牙槽嵴宽度及高度与邻牙基本相平,骨缺损区质地较韧,HE染色提示炎性渗出明显吸收,可见新生骨组织,骨缺损区周围有大量成骨细胞,骨小梁较空白组致密,骨涎蛋白免疫组化成强阳性表达,与空白组有明显差异。由此可知,牙髓干细胞有向成骨分化能力,促进牙槽骨缺损的修复。     

牙髓干细胞的研究新进展

牙髓干细胞是存在于牙髓组织中的一种成体干细胞,具有高度增殖、自我更新的能力和多向分化的潜能。牙髓干细胞的研究对牙组织工程和牙齿的再生将产生重要的意义。     

携人源TPA基因的慢病毒表达质粒的构建与鉴定

利用PCR扩增人源TPA基因,再用酶切-连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-PGK-eGFP中,最后用测序、酶切和在293细胞中瞬时表达的方法进行了鉴定.结果显示：含人源TPA基因的pL-PGK-TPA-eGFP慢病毒表达载体构建成功,为进一步利用转基因技术更加安全高效地生产TPA,治疗血栓类疾病打下基础.     

不同重组慢病毒介导人凝血因子Ⅸ cDNA在血友病B小鼠中表达的影响

血友病B是凝血因子Ⅸ(hFⅨ)缺乏所导致的严重凝血功能障碍、X-连锁隐性遗传性疾病,在男性中的发病率为三万分之一．目前没有理想的治疗措施,而基因治疗可能是根治该病的安全、有效方法．该实验构建了ubiquitin—c和ABP(肝特异性)启动子指导hFⅨ表达的载体FUXW、FAXW,利用磷酸钙法共转染三质粒制备高滴度的重组慢病毒．将不同剂量的重组FUXW、FAXW病毒,分别用尾静脉液压法和静脉缓注法注射入血友病B小鼠体内,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为45ng／mL,表达持续超过60d．结果表明：hFⅨ蛋白的表达与病毒的剂量成正相关,重组FAXW病毒的hFⅨ表达量高于重组FUXW病毒,而尾静脉液压组和静脉缓注组在表达量、表达时间上没有显著差异．     

绿色荧光蛋白基因在裂殖酵母中的表达

将绿色荧光蛋白基因编码区序列克隆到大肠杆菌－裂殖酵母穿梭质粒ｐＲＥＰ３的ＢａｍＨⅠ￣ＳｍａⅠ位点,使之位于一个受硫胺素抑制的启动子和终止子的控制之下,用该质粒转化裂殖酵母,转化菌落于阳光下呈绿色,在３９５ｎｍ紫外光下发出强烈绿色荧光,在荧光显微镜下,用蓝光激发,可见该基因的表达明显受硫胺素的抑制,在没有选择压力的条件下,质粒丢失现象很严重,在完全培养基上,只有２０％的细胞发光,在丰富培养基上,发光     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B.     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

Hemophilia B, a serious bleeding disorder, is an inherited X chromosome-linked disease for the deficiency or inactivity of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ). Though factor substitution therapy has greatly improved the lives of hemophiliac patients, there are still limitations to the current treatment, which have triggered interest in alternative treatments by gene therapy[1]. Based on preclinical studies in rabbits[2], our lab had first initiated an ex vivo gene therapy clinical trial whereby a…     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不同时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达．结果发现,GFP基因在Adv．GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达．本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不N时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达,结果发现,GFP基因在Adv-GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达,本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

真核生物多顺反子表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

利用DNA重组技术将抗肿瘤血管生成的内皮抑素基因endostatin插入含有FHIT(抗肿瘤人脆性组氨酸三联体基因)和EGFP的pIRES2-FHIT-EGFP载体中构建了真核多顺反子表达载体pES-IRES-FHIT-IRES-EGFP,用脂质体法转染Hela细胞后,用G418筛选出稳定转染的细胞.经RT-PCR、RT-PCR southern blot、northern blot和免疫细胞化学分析,结果证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达.在蛋白表达水平上,荧光观察和免疫细胞化学分析结果显示Endostatin、FHIT和EGFP在Hela细胞中均得到表达,为基因药物和肿瘤多基因治疗奠定了基础.     

人牙髓细胞三维生物打印的初步研究

通过生物打印方法构建含人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)的组织工程三维结构体。探讨对hDPCs进行三维生物打印的可行性。用常规体外培养hDPCs至第4代。将细胞悬液与海藻酸钠-明胶水溶胶混合,制备hDPCs-海藻酸钠-明胶水溶胶共混物。细胞终密度为2×106/mL。用生物打印机根据预先设计的参数进行生物打印,构建组织工程三维结构体。对结构体进行肉眼观察和倒置相差显微镜观察。用钙黄绿素-AM和碘化丙啶双荧光染料对结构体进行染色,激光共聚焦显微镜观察分析结构体中hDPCs的活性。通过生物打印技术的结果可按照预先设计的参数打印出含有hDPCs的网格状的水凝胶结构体,该结构体的大小约为5 mm×5 mm×1.5 mm。倒置相差显微镜下可见结构体内微丝的直径约300μm,微丝间的孔隙相互通连,孔隙大小约350μm×350μm,hDPCs在结构体中呈球形均匀分布。激光共聚焦显微镜观察证实结构体中大部分细胞存活。初步证明hDPCs可耐受生物打印过程。通过研究说明三维生物打印技术构建出了含人牙髓细胞的组织工程三维结构体,实现了hDPCs的生物打印,为生物打印技术应用于牙组织工程奠定了基础。     

pBK-CMV⊿-EGFP-SNAT2质粒载体构建及其表达鉴定

SNAT2是SLC38基因家族编码的Na＋偶联中性氨基酸转运蛋白中属于systemA的成员之一．它在谷氨酸一谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用．增强型绿色荧光蛋白EGFP的连接对于SNAT2在细胞表达中的定位以及检测都有很大的帮助．采用PCR扩增和酶切技术将EGFP连接到质粒pBK-CMV△-SNAT2中SNAT2的N端．通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和测序验证得到pBK-CMV△-EGFP—SNAT2质粒载体,将构建好的质粒瞬时转染进人胚肾细胞（HEK293cells）用Westernblot和激光共聚焦电子显微镜检测EGFP-SNAT2的表达与亚细胞定位．结果表明：EGFP．SNAT2在细胞中正确表达并定位于细胞膜上．pBK．CMV么．EGFP．SNAT2质粒载体的构建对于进一步研究SNAT2的结构和功能具有重要意义．