A型口蹄疫病毒VP1免疫活性肽基因串联片段的化学合成及克隆与表达

A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白的141～160和200～213位氨基酸序列是决定FMDV免疫原性的抗原决定簇片断．人工合成一个免疫活性肽基因的串连片段（20AA－14AA-20AA）、全部选用大肠杆菌偏爱密码子．在5’端带有EcoR1位点和一个起始密码子ATG，在3’端带有BamH1位点和一个终止密码子TGA．利用这两个酶切位点把该基因连接到pWR590质粒上．并筛选高表达的菌株．结果表明该融合蛋白在大肠杆菌JM101中能高表达．经斑点ELISA实验证明．大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有A型FMDV抗原活性．     

抗A5型口蹄疫病毒重组多肽疫苗的研究

根据A型口蹄疫病毒（FMDV）的VP1基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位,并结合对口蹄疫病毒的研究成果。设计了A型FMDV的重组多肽疫苗．分别选择VP1上21～40位和137～160位氨基酸对应的基因序列为表位基因,组成137～160—21～40-137～160的串连结构,并以大肠杆菌β-半乳糖苷酶为大分子载体,构建重组质粒pLM99,在大肠杆菌中表达得到高含量的融和蛋白．体外免疫原性检测表明,所表达的融和蛋白与标准A型阳性血清有特异性抗原／抗体反应,即说明该融和蛋白具有免疫反应性．免疫豚鼠的实验结果表明,融合蛋白能在豚鼠体内诱导中和抗体,并使70％的豚鼠能抵抗病毒的攻击．     

含T细胞表位和B细胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗诱导豚鼠产生免疫反应

用FMDV疫苗免疫接种是预防口蹄疫的主要手段之一 .研制既含B细胞表位又含T细胞表位的基因工程疫苗对口蹄疫的防治具有更强的保护能力 .用化学方法合成O型口蹄疫病毒 (FMDV)外壳蛋白VP1中 2 1～ 40位肽段的T细胞表位基因 ,与 1 41～ 1 60肽段的B细胞表位基因串联后 ,与 β 半乳糖苷酶基因相连 ,构建成一重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达出融合蛋白疫苗 .动物实验表明 ,该疫苗不仅能诱导豚鼠产生滴度很高的中和抗体 ,而且产生大量对病毒专一性T细胞 ,与不含 2 1～ 40肽段的疫苗相比 ,用该疫苗免疫的豚鼠血单个核细胞对FMDV的反应性提高 7倍以上 ,并能抵抗病毒攻击 .说明该疫苗可同时激活体液免疫及细胞免疫反应 ,有较强的保护作用 .     

亚洲一型口蹄疫病毒YNAs1.1株结构蛋白VP1基因的核苷酸序列分析

提取BHK21细胞增殖的亚洲一型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus Serotype Asial)强毒株YNAs1.1的RNA,用一对引物P7,P13经反转录（RT）－PCR法扩增了约674bp的DNA片段。克隆目的基因后,采用双脱氧DNA链末端终止法测得了YNAs1.1的VP1基因36－633核苷酸序列。分析表明,病毒VP1基因的核苷酸序列与以色列以及印度已报道的Asia1型FMDV的同源性分别为82.11%与88.07%,对应的氨基酸序列同源性为87.94％与93.47％。该序列在GeneBank登陆号为AF241566。     

水稻白叶枯病菌luxR同源基因的克隆和表达

luxR基因是革兰氏阴性菌感应反应（Quorum Sensing,QS）LuxR／Luxl环路中起重要作用的基因．从水稻白叶枯病菌中分离到一个luxR同源基因,命名为xooR．xooR全长765bp,编码一个由254个氨基酸残基组成的转录因子,分子质量和等电点分别为28．3ku和8．72．XooR蛋白的N一端15AA-171AA是一个Autoindbind结构域,C-端191AA-245AA是一个HTH（helix-turn-helix）结合DNA结构域利用原核表达载体pET-24a（＋）和gfp基因构建融合蛋白表达系统,Western blot分析表明XooR-GFP融合蛋白大小为54ku,xooR基因成功地在E．coliB1．21中实现了表达．     

共表达鸡IBDV VP2和IL-2基因的重组毕赤酵母的构建及免疫原性

通过重叠延伸PCR扩增IL2-VP2串联基因,克隆到pMD18-T载体上,亚克隆正向插入到毕赤酵母表达质粒pPICZαA中,经PCR和双酶切鉴定表明成功构建了酵母重组表达载体pPICZαA-IL2-VP2。将该重组质粒线性化后电击转化入感受态毕赤酵母X-33菌株,构建成分泌型表达IL2-VP2的酵母工程菌株。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE、Western-blot活性检测分析表明IL2-VP2基因长度为1.85kb,包含缺失了TAA终止密码子的IL-2基因和缺失了ATG起始密码子的VP2基因,两个基因之间以高度柔韧性的(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸相连接,并在该体系中得到分泌表达,分子量约为50kD,且表达产物对传染性法囊病毒具有较好的反应原性。     

MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究

研究表明,口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇.根据O/HL-JOC12/03猪源FMDV毒株VP1上第141～160位氨基酸序列设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术将该序列插入在大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点.然后连接到原核表达载体pET28a上,构建了重组表达质粒28a-CP-VP1,转化BL21(DE3),ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1.透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)状.间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FM-DV的阳性血清,30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生高效价的特异抗体.故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的VLPs蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景.     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaI型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒（FMDV）毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B,分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守．分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA（short-hairpin RNA,shRNA）表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和p213-NT25．进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性．结果显示,3D-NT56／19,VP4-NT65／19和2B—NT25 shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对Asia I型FMDV,仅2B-NT25 shRNA具有较显著的抑制作用．3个shRNA表达质粒的混合使用（p3D-NT56＋pVP4-NT65＋p2B-NT25,p3D-NT19＋pVP4-NT19＋p213-NT25）,不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间．     

O型口蹄疫病毒VP1基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

旨在构建能够表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的重组山羊痘病毒(GPV),并以此为活载体疫苗,评估其免疫效力.将FMDV的VP1基因插入转移质粒pTKfpgigp中,构建重组转移质粒pTKfpgigp-VP1,并转染已感染GPV的羔羊睾丸(LT)细胞,产生重组GPV(rGPV),筛选纯化rGPV,检测rGPV在LT细胞中VP1基因的表达情况.将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘(GP)和口蹄疫(FMD)特异性抗体水平.结果表明,获得含有FMDV的VP1基因重组毒株rGPV/FMDVVP1,在LT细胞中VP1基因进行正常转录,其表达产物能与FMDV抗血清产生特异性反应.rGPV能诱导产生不同水平的抗GP和FMD的特异性抗体.可为FMD重组标记疫苗的研制提供参考.     

猪口蹄病毒VP1活性肽融合蛋自的纯化

在猪口蹄疫病毒（FMDV）活性肽VP1融合蛋白基因工程菌E．coliC500构建成功的基础上,确定了融合蛋白的分子质量约为71．0ku．对于融合蛋白的提纯,确定了超声波破壁,尿素分级纯化,葡聚糖G－100柱层析,DEAE纤维素DE－52柱层析的方法,将目的蛋白提纯了6．75倍,SDS－PAGE呈一条带．并比较了融合蛋白的半乳糖苷酶反应（ONPG）和酶的温度敏感性等性质的变化．     

含T细胞表位和B细胞表位的抗O型FMDV基因工程疫苗诱导豚 …

用ＦＭＤＶ疫苗免疫接种是预防口蹄疫的主要手段之一,研制既含Ｂ细胞表位又含Ｔ细胞表位的基因工程疫苗对口蹄疫的防治具有更强的保护能力,用化学方法合成Ｏ型口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）外壳蛋白ＶＰ１中２１～４０位肽段的Ｔ细胞表位基因,与１４１～１６０肽段的Ｂ细胞表位基因串联后,与β－半乳糖苷酶基因相边,构建成一重组质粒,并在大肠杆菌中表达出融合蛋白疫苗,动物实验表明,该疫苗不仅能诱导豚鼠产生滴度很高的中和抗体,     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B, 分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和p2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25 shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25 shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒的混合使用(p3D-NT56+pVP4-NT65+p2B-NT25,p3D-NT19+pVP4-NT19+p2B-NT25),不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B,分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒(p3D-NT56 pVP4-NT65 p2B-NT25,p3D-NT19 pVP4-NT19 p2B-NT25)的混合使用,不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

家畜口蹄疫新型疫苗研制与生产工艺创新2014年度报告

<正>在研制的口蹄疫新型疫苗有10多种,分别是纳米微球黏膜免疫疫苗,表位肽疫苗、口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗、A型重组毒株(Re-A/WH/2009)的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗、猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗、口蹄疫O型标记疫苗、猪O型Mya98毒株空衣壳疫苗、猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)、牛口蹄疫(O型、Asia1型)二价合成肽疫苗、以及口蹄疫病毒活载体疫苗。其中取得突破性进展的有5种,牛口蹄疫(O型、Asia1型)二价合成肽疫苗PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,已完成所有实验室研究和临床试验,申请了新兽药注册并已通过初审;猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,已完成所有实验室研究和临床试验,现已申请新兽药注册并通过复核试验和复审;含A型重组毒株(Re-A/WH/2009)的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗PD50值大于6.0,免疫持续期为6个月,保存期为12个月,获得了农业部新兽药注册证书,实现了产业化;猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗已申报农业部临床试验批文;口蹄疫O型标记疫苗已完成疫苗质量研究,并已申请新兽药注册。其他疫苗研究也均取得了程度不等的进展。利用反向遗传操作技术平台,获得基因工程修饰病毒疫苗株5株:(1)r V-STN-5;(2)9O/r V-1;(3)Re-A/WH/2009;(4)Re-Mya/98/BY/2010;(5)Re-Asia1/HN/2006。利用基因克隆、重组等技术,获得其他基因工程修饰病毒9株,分别为:(1)表达O型FMDV不同亚型主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株;(2)共表达O-A-Asia1型FMDV主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株;(3)表达FMDV免疫原性基因的杆状病毒2株;(4)表达猪源IFN-α/IFN-γ和A型FMDV P1基因的重组杆状病毒3株;(5)表达口蹄疫和小反刍兽疫病毒主要保护性抗原基因的重组羊痘病毒2株。成功研制Cp G-IFN、Cp G-IL4以及多磷腈和Cp G DNA等生物复合佐剂3种,纳米乳油佐剂、纳米粒IL-2佐剂以及多孔硅和上转换荧光纳米材料的载药系统等纳米复合佐剂材料4种,以及IL-2、IL-4和IFN-γ等多种哺乳动物细胞表达质粒和多糖类免疫增强剂4种。     

LacZ基因作为报道基因在植物基因工程中的应用

通过农杆菌（Agrobacteriumtumfaciens）的介导，将β-半乳糖苷酶基因（Lacz）转入烟草中，得到的转化株能在含有卡那霉素和梭苄青霉素筛选培养基上正常生长，Nopaline检测表明转化体中具有章鱼碱合成酶（NOS）的活性．1．5％的戊二醛可以固定植物中的内源背景，X-gal染色可以很好地显示出外源目的基因LacZ的表达．从而确定广泛用于动物和微生物基因工程的报道基因LacZ可以用于植物基因工程研究．     

重构猪SLA-I单链复合体及其口蹄疫病毒VP1蛋白限制性表位的筛选

目前,没有研究猪SLA-I类复合体限制性表位的系统.为了构建猪的SLA-I类复合体,研究其相应重要病毒的限制性表位,亚克隆猪主要组织相容性复合体重链基因SLA-2胞外区和轻链基因β2m成熟肽区,利用一富含甘氨酸和丝氨酸的Linker(G4S)3连接两个基因,通过SOEPCR体外构建了猪可溶性的单链复合体SC-SLA-I[SLA-2-(G4S)3-β2m],计算机方法设计3类口蹄疫病毒VP1蛋白的T细胞表位,经化学合成,分别命名为PepⅠ(FMDV/VP126—34)、PepⅡ(FMDV/VP1157—165)和PepⅢ(FMDV/VP145—53),用以结合单链复合体蛋白SC-SLA-I.酸洗脱结合质谱法测定SC-SLA-I结合表位,同时设定非相关蛋白和多肽的对照试验.结果显示,Pep Ⅰ和Pep Ⅱ均能和SC-SLA-I结合,而Pep Ⅲ及非相关多肽不能结合,对照蛋白MBP的肽结合试验显示阴性.结果表明,多肽Pep Ⅰ和Pep Ⅱ属于SLA-I类限制性表位.     

莱芜猪和沂蒙黑猪IGF-Ⅰ基因的多态性及生长性状的关联性分析

采用PCR-SSCP方法对莱芜猪（127头）和沂蒙黑猪（132头）的胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因exon3和exon4分别进行单核苷酸多态性分析.发现exon3上有多态性，且存在3种基因型（AA、AB、BB）.统计结果表明，3种基因型在两品种中的分布不一致，差异极显著（P〈0.01）.固定效应模型分析结果表明，初生重、断奶重和6月龄重基因型间差异不显著（P〉0.05）.最小二乘分析结果表明，BB基因型与其它2种基因型比较有较大的初生重，同AA和AB型比较差异极显著（P〈0.01），3种基因型在初生重的大小排列顺序为AA〈AB〈BB．因此，推测IGF—Ⅰ基因对个体的初生重存在一定的影响，选择带有B等位基因的个体，有望提高个体的初生重．     

小麦AGPase胞质型小亚基SSUⅠ的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基（AGPase plastic small subunit,SSU Ⅰ）的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp（GenBank No.EF405961）,编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明：与GenBank上已报道的SSU I基因（X66080,AF244 997,Z48562）同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU Ⅰ S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU Ⅰ的反义表达载体pBI121SSU Ⅰ A.同时还克隆出SSU Ⅰ基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU Ⅰ.     

靶向基因疫苗pcDNA3/MDC-VP1的构建及免疫效果

用RT-PCR扩增小鼠巨噬细胞源趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)基因,与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)VP1基因通过一个编码10个氨基酸残基的接头序列(Gly4Ser)2相连,形成融合基因MDC-VP1,构建真核表达质粒pcDNA3/MDC-VP1,作为疫苗免疫BALB/c小鼠.3次免疫后,pcDNA3/MDC-VP1组小鼠血清中和抗体滴度明显高于pcDNA3/VP1组;而病毒滴度低于pcDNA3/VP1组.用10 LD50CVB3攻击,pcDNA3/MDC-VP1组小鼠生存率为50%,用Kaplan-Meier法进行生存分析,生存率高于其他各组.     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用

设计切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酸Rz－2，分别以pKyLx7和pBin19为载体，构建含Rz－2基因及核酸和底物连接的RzSb－2基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ti质粒．重组Ti质粒通过PEG法转化烟草原生质体，同时对转化的原生质体接种TMVc一定时间后以半叶法检测原生质体中病毒的侵染性．结果表明转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照，推测病毒在转基因的原生质体中复制受到干扰；且核酸Rz－2（正向）表达后作用最为明显，核酸连底物RzSb－2（正向）与RzSb～2（反向）之间有明显差别．