Penicillium sp.DS9701-09分泌的聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的纯化及性质研究

以Penicillium sp.DS9701-09为研究对象,对其分泌的PHB解聚酶进行分离纯化和表征,通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀和SephadexG-100凝胶过滤,从发酵液中纯化了一种对PHB具有高效降解能力的解聚酶,纯化倍数为37.9,酶活力回收率为8.9%.经SDS-PAGE检测,确定酶蛋白的相对分子质量为41.5 kDa.酶反应的最适温度和pH分别为50℃和5.0,在50℃以下和pH=5.0～6.0之间酶的稳定性较好.金属离子对PHB解聚酶具有一定的抑制作用,降解酶对PHB的酶解产物主要是羟基丁酸二聚体.     

内含肽介导的鼠多瘤病毒样颗粒生产表达和纯化

鼠多瘤病毒样颗粒(VLPs)可由结构蛋白VP1自组装而成,可用于疫苗开发、基因治疗、药物传递和生物材料等方面.针对目前VP1生产中需要凝血酶去除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,生产成本较高、操作复杂的问题,利用内含肽(intein)自剪切的特征,将内含肽插入到VP1与GST标签之间进行融合表达,表达产物经亲和色谱纯化,并通过改变柱内pH值、温度诱导内含肽剪切,使VP1与GST-intein分离从而获得VP1蛋白,产量为4,mg/(L培养基).纯化的VP1可自组装成与天然鼠多瘤病毒样颗粒一致的VLPs.结果表明,内含肽介导鼠多瘤病毒样颗粒生产纯化流程简单易行,且无需凝血酶参与,大幅降低成本,为VLPs的高效制备奠定了基础.     

聚β-羟基丁酸酯(PHB)的研究及应用前景

介绍了积累聚 β-羟基丁酸酯 ( PHB)的细菌种类 ,国内外关于 PHB研究的进展、发展状况及 PHB的独特性质和应用前景 ,并概括论述了 PHB的合成及降解途径     

DS 9701菌株的紫外诱变及PHB解聚酶高产菌株的筛选

以青霉(Penicillium.sp)DS 9701为出发菌株,通过紫外线诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶培养复筛的方法,获得一突变株,编号DS 9701-M 09.该突变株的PHB解聚酶活力是原始菌株的2.3倍,经传代培养,该菌株的PHB解聚酶高产特性稳定遗传.     

生物合成聚β羟基丁酸酯(PHB)的研究现状与应用前景

本文对国内外PHB的研究现状和生物合成途径进行了较为详尽的综述,介绍了各种生物合成途径的特点和存在的问题以及今后的发展前景。     

培养条件对蓝细菌生长及PHB积累的影响

对蓝细菌集胞藻 (Synechocystis) sp. PCC6 80 3的细胞生长及胞内聚 -β-羟基丁酸酯 (PHB)的积累进行了研究 ,以探索提高蓝细菌 PHB积累水平的可能性。野生型集胞藻于 BG- 11培养基中通气培养 ,改变氮源浓度、碳源种类、光照强度 ,测定细胞的生长及胞内 PHB的浓度。结果表明 :只有在氮饥饿培养时 ,胞内 PHB水平才会有明显提高。氮饥饿条件下 ,混养生长时收获的细胞量最多 ,弱光自养时细胞几乎不生长 ,两种条件下 PHB的积累水平相近 ,低于细胞干重的 0 .5 %。异养时细胞生长与混养时相近 ,PHB可积累至细胞干重的 1.0 %。强光自养最有利于 PHB的积累 ,生长 7d后可积累至细胞干重的 4.1%。该研究的结果可为进一步提高蓝细菌中 PHB的积累水平提供参考     

一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究

自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统,以酿酒酵母为宿主,p HR质粒为表达载体,构建微型内含肽ΔI-CM intein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白Ig G的Fc domain为亲和标签,绿色荧光蛋白gfp为报告蛋白,在酿酒酵母GPD强启动子作用下,表达出融合的Fc-intein-gfp蛋白。检测发现融合序列在起始密码子ATG前加入一段Kozak序列有利于gfp表达。在此基础上,将微型内含肽ΔI-CM intein序列替换成密码子优化的ΔI-CMintein-O序列,显著促进gfp蛋白的表达量,初步实现了ΔI-CM intein融合蛋白的高效表达。为新型自剪切内含肽酿酒酵母表达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。     

产 PHB 重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

从工程应用的角度研究了重组Ｅ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ｐＴＺ１８Ｕ－ＰＨＢ）的质粒稳定性，结果表明，质粒ｐＴＺ１８Ｕ－ＰＨＢ具有结构稳定性和分裂不稳定性，ＰＨＢ在胞内的大量积累和重组菌较低的生长速率增加了质粒的分裂不稳定性。为了保证细胞的正常生长及表达，在种子培养基中必须添加氨苄青霉素（Ａｐ）；由于接种时种子带入的１０ｍｇ／ＬＡｐ足以杀死丢失了质粒的细胞，因而在摇瓶发酵阶段不必再添加Ａｐ。在ＬＢ和ＬＢＧ培养基中传代１８次后，带质粒的菌分别为７．４％和３．５％；细胞每分裂一次，质粒的平均丢失率分别为０．９６％和０．９３％。并建立了野生菌的Ａｐ敏感动力学方程和质粒丢失的动力学方程     

聚β-羟基丁酸酯解聚酶的分离纯化及性质研究

研究了青霉Penicillium sp.DS9713a产聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的情况,并通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀及Sepharose CL-6B凝胶色谱对PHB解聚酶进行了分离纯化,获得了解聚酶的纯酶组分,纯化倍数为59.1,回收率为20%。经检测该酶的分子量约为18000Da,等电点为7.6,化学试剂EDTA、SDS及巯基乙醇对酶活均有较强的抑制作用,而H2O2和尿素对酶活的抑制不明显;同时,对该纯酶组分的蛋白性质进行了测定,结果显示该酶天冬氨酸和谷氨酸含量较高,推测与底物结合作用相关,二级结构以α螺旋为主,不含β折叠;降解产物的质谱分析显示,该酶的作用产物为3HB单体,暗示其以外切模式对PHB进行降解。     

缺氧条件下活性污泥中PHB的生物合成

在序批式反应器(sequencing batch reactor,SBR)中驯化活性污泥,富集聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)积累菌,并研究驯化后活性污泥的PHB合成能力.污泥驯化采用好氧动态供料法,为期3个月.PHB合成实验在缺氧条件下进行(通气量为80.L/h,溶解氧为0.mg/L),温度为20.℃,活性污泥初始质量浓度为1.200.mg/L,乙酸钠质量浓度为931.5.mg/L(以C计).结果表明,驯化后活性污泥中PHB积累菌占优势,具有PHB合成的能力.投加乙酸钠931.5.mg/L(C),在缺氧条件下,活性污泥中PHB含量于feast(底物丰富)阶段末达最高值45.4%.feast阶段内乙酸钠消耗94%,其中53.4%的乙酸钠被转化为PHB,2.7%乙酸钠用于合成污泥活性生物量,供污泥生长.因此,好氧动态供料法驯化后的活性污泥具有较强的PHB合成能力,生长缓慢.     

复合干扰素在毕赤酵母中的表达与纯化

根据复合千扰素的氨基酸序列和毕赤醉母密码子偏爱性,利用重叠延伸PCR的方法合成复合干扰素DNA序列,克隆至分泌型醉母表达载体pGAPZαA,线性化后经高效电转化、Zeocin筛选鉴定及培养条件优化,获得了重组复合干扰素高表达菌株pGAP-conIFN/GS115,重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中.培养液上清经盐析、凝胶过滤和阴离子交换层析进行纯化,最后用分子筛脱盐.SDS-PAGE分析显示,纯化后的目标蛋白纯度可达到92%左右,比活性可达5.5×108 U/mg.     

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用pET-39b( )构建了融合表达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37℃在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中培养,当细胞密度(D600)达到0.5时,降低温度到28℃,加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代-βD-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6 h后收集菌体,融合蛋白(DsbA-sBEKLC)产量达到151.2mg/L,相当于80.6 mg/L sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mg sBEKLC,经检测sBEKLC具有生物活性.     

锌指蛋白Zbed3的表达与分离纯化

将编码小鼠锌指蛋白Zbed3的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28c,构建了含组氨酸标签的表达质粒pET28c-Zbed3,并将其转入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP;在20℃条件下,采用100μmol/L的异丙基硫代--βD半乳糖苷(IPTG)诱导、培养20 h而获得含Zbed3的菌体;菌体裂解液经超滤浓缩后采用镍(螯合)柱分离纯化得到锌指蛋白Zbed3(浓度达60 mg/L);同时,采用30%醋酸溶解包涵体,用0.5 mol/L的Tris-HCl(pH=8.8)缓冲液中和而使Zbed3在生理pH环境中复性.结果表明,Zbed3复性后在离心上清液中的回收率达到80%,其复性蛋白质与表达产物为可溶性(天然态)Zbed3的圆二色性光谱特征相一致,以此验证了复性后Zbed3空间构象的正确性.     

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出神经营养素-4基因(NT-4)成熟蛋白的DNA序列,并将其克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经Ni^2 -NTA树脂亲和层析纯化,得到了纯度达94％的NT-4成熟蛋白的融合蛋白．为进一步研究NT-4的生物学活性及在临床治疗中的作用打下了基础．     

腈水合酶在大肠杆菌中的表达纯化

微生物的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂,广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。实验先构建得到BL21-pGEX-4T-1/NHase重组菌,表达GST-NHase融合蛋白。由于GST的相对分子质量较大,阻碍了腈水合酶的β亚基与α亚基的正确结合,从而使腈水合酶表现不出酶活。于是又构建了BL21-pET-30c/NHase重组菌,IPTG诱导表达结果显示,腈水合酶α亚基基本没有得到表达,影响了腈水合酶的活性。经生物信息学分析发现,腈水合酶α亚基的起始密码子为gtg,可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别,于是通过点突变将gtg替换成atg,阳性重组子经IPTG诱导表达,结果显示腈水合酶β亚基和α亚基的表达量都有所提高。诱导表达的菌液经超声破碎,离心得到粗酶液,用EPI-30-ARG-IDA-Co2+亲和载体纯化带6×His tag的腈水合酶,气相色谱法检测腈水合酶的酶活达到200 U/mL。     

生物填充疗法治疗西藏大骨节病患者血清细胞因子水平和疗效观察

目的：分析西藏大骨节病患者用生物填充剂透明质酸钠膝关节注射治疗前后血清中细胞因子水平的变化与治疗效果。方法：选择西藏拉萨地区尼木县、墨竹工卡县、林周县等大骨节病区患者和病区健康对照组成人共252例为调查对象,依据大骨节病诊断标准,将其分为大骨节病组（KBD组,156例）和健康对照组（96例）,患者平均年龄和性别无差别。KBD组中106例膝关节注射透明质酸钠,50例口服Vc。采用ELISA法测定血清中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、透明质酸（HA）水平,硝酸还原酶法测定一氧化氮含量。结果：注射治疗后一周症状明显缓解,且疗效显著优于口服Vc。大骨节病组血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）一氧化氮含量等显著高于对照组人群,但透明质酸含量低于对照组。治疗后三个月血清细胞因子水平有下降趋势,但无统计学显著性。结论：膝关节注射生物填充剂透明质酸钠治疗西藏大骨节病,可缓解临床症状,改善关节功能,其作用可能是通过润滑关节,降低血清滑液中炎性细胞因子如TNF-1α、IL-1β等水平的作用来实现。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

甜味蛋白Brazzein在Escherichia coli和Bacillus subtilis中的表达研究

通过实验对比研究了植物来源的甜味蛋白Brazzein单独及与E coli信号肽融合表达的情况,证实无信号肽序列的Brazzein编码基因实现了可溶性活性表达,它的肽链N端未融合其他氨基酸或肽链.同时,在Brazzein肽链中引入31His→Ala的突变,依照Bacillus subtilis的偏爱密码子,合成了定点突变后的Brazzein编码序列,并在B.subtilis WB600中实现了可溶性胞内表达,得到了表达量较高的活性蛋白产物.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。