一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究

自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统,以酿酒酵母为宿主,p HR质粒为表达载体,构建微型内含肽ΔI-CM intein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白Ig G的Fc domain为亲和标签,绿色荧光蛋白gfp为报告蛋白,在酿酒酵母GPD强启动子作用下,表达出融合的Fc-intein-gfp蛋白。检测发现融合序列在起始密码子ATG前加入一段Kozak序列有利于gfp表达。在此基础上,将微型内含肽ΔI-CM intein序列替换成密码子优化的ΔI-CMintein-O序列,显著促进gfp蛋白的表达量,初步实现了ΔI-CM intein融合蛋白的高效表达。为新型自剪切内含肽酿酒酵母表达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。     

融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定

猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.     

重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定

对巴斯德毕赤酵母高效分泌表达的猪α-干扰素(PoIFN-α)纯化工艺和纯化后重组蛋白的部分生化特性进行了研究,结果表明:猪α-干扰素(PoIFN-α)发酵液经离心、透析、过滤处理之后,依次利用亲和层析和离子交换层析使目的蛋白得到了纯化.经N端氨基酸测序,Westem-blot,对酸、热、巯基乙醇的稳定性和糖基化程度等检测后发现,所表达的猪α-干扰素N端氨基酸序列(前5个)正确,对酸和热基本稳定,二硫键对目的蛋白的活性至关重要,没有发现目的蛋白的糖基化.     

内含肽介导的鼠多瘤病毒样颗粒生产表达和纯化

鼠多瘤病毒样颗粒(VLPs)可由结构蛋白VP1自组装而成,可用于疫苗开发、基因治疗、药物传递和生物材料等方面.针对目前VP1生产中需要凝血酶去除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,生产成本较高、操作复杂的问题,利用内含肽(intein)自剪切的特征,将内含肽插入到VP1与GST标签之间进行融合表达,表达产物经亲和色谱纯化,并通过改变柱内pH值、温度诱导内含肽剪切,使VP1与GST-intein分离从而获得VP1蛋白,产量为4,mg/(L培养基).纯化的VP1可自组装成与天然鼠多瘤病毒样颗粒一致的VLPs.结果表明,内含肽介导鼠多瘤病毒样颗粒生产纯化流程简单易行,且无需凝血酶参与,大幅降低成本,为VLPs的高效制备奠定了基础.     

重组人干扰素α2a和胸腺肽α1融合蛋白的分子设计及其基因表达产物的鉴定

人干扰素α_2a（IFNα_2a）和胸腺肽α₁（THYα₁）联合使用效果远大于各自单独使用的效果，本文通过DNA重组技术将两者构建成一个融合蛋白药物。首先，依据IFNα_2a和THYα₁的分子结构，设计了一个连接肽，将IFNα_2a和THYα₁相连，并分别位于该融合蛋白的N端和C端。在此基础上，构建出表达载体pCJ101质粒，获得的阳性克隆307在2×YT培养基小试中，产物变性复性后经DEAE-Sepharose柱层析纯化后，在SDS-PAGE上得到相对分子质量为23000的谱带。经鉴定，融合蛋白中干扰素α_2a的比酶活性为1.34mol/s·g；检测胸腺肽α₁的活性，显示活性E玫瑰花结形成率达到20%。结果表明，融合蛋白中两种药物蛋白均较好地保持各自的生物功能，为继续研究奠定了良好基础。     

Penicillium sp.DS9701-09分泌的聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的纯化及性质研究

以Penicillium sp.DS9701-09为研究对象,对其分泌的PHB解聚酶进行分离纯化和表征,通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀和SephadexG-100凝胶过滤,从发酵液中纯化了一种对PHB具有高效降解能力的解聚酶,纯化倍数为37.9,酶活力回收率为8.9%.经SDS-PAGE检测,确定酶蛋白的相对分子质量为41.5 kDa.酶反应的最适温度和pH分别为50℃和5.0,在50℃以下和pH=5.0～6.0之间酶的稳定性较好.金属离子对PHB解聚酶具有一定的抑制作用,降解酶对PHB的酶解产物主要是羟基丁酸二聚体.     

聚β-羟基丁酸酯解聚酶的分离纯化及性质研究

研究了青霉Penicillium sp.DS9713a产聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的情况,并通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀及Sepharose CL-6B凝胶色谱对PHB解聚酶进行了分离纯化,获得了解聚酶的纯酶组分,纯化倍数为59.1,回收率为20%。经检测该酶的分子量约为18000Da,等电点为7.6,化学试剂EDTA、SDS及巯基乙醇对酶活均有较强的抑制作用,而H2O2和尿素对酶活的抑制不明显;同时,对该纯酶组分的蛋白性质进行了测定,结果显示该酶天冬氨酸和谷氨酸含量较高,推测与底物结合作用相关,二级结构以α螺旋为主,不含β折叠;降解产物的质谱分析显示,该酶的作用产物为3HB单体,暗示其以外切模式对PHB进行降解。     

人αB干扰素基因在PGK1启动子和α因子前导序列控制下在酵母中的表达和分泌

借助化学合成的寡聚核苷酸接头将酵母PGK1启动子和α因子前导序列相连构建成一个αB干扰素基因的分泌表达载体YFD65.含质粒YFD65的酵母菌BJ1991能分泌表达αB干扰素,分泌到培养基中的αB干扰素的量为10~8U/L.     

人α－干扰素基因在小菜蛾细胞中的表达及其影响因素探讨

将含有人α－干扰素（ＩＦＮα）基因的杆状病毒转移载体（ｐＡｃ３７３－ＩＦＮα）与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－Ｐｘ２－ＨＮＵ３,Ｐｘ）,空斑纯化后,利用细胞致病效应（ＣＰＥ）抑制法检测得到了干扰素效价（６８７２．６ＩＵ）,证明得到了可以在Ｐｘ细胞中表达ＩＦＮα的重组病毒（Ａｃ－ＩＦＮα）．并探讨了培养温度和血清浓度对ＩＦＮα表达水平的影响,结果表明：在２８℃时,培养基中补加２％的小牛血清,可获得最高的ＩＦＮα效价（１７４３５．９ＩＵ）．     

黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs的真核可溶性表达

将黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）抗真菌肽基因Drosomycin（Drs）克隆到pPICZα-A载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-Drs,转化宿主菌Pichia pastoris X-33.在 AOX1（醇氧化酶）启动子调控下,抗真菌肽DRS成功表达,其分子量约为5 kD.抑菌试验显示,DRS对供试真菌有明显的抑菌活性.采用考马斯亮蓝法测定抗真菌肽的具体表达量,并优化了诱导条件.     

几株反硝化聚磷菌的筛选及其生理生化特性的鉴定

为研究反硝化聚磷菌的生物学特性,通过吸磷试验、硝酸盐还原产气试验及异染颗粒和PHB颗粒染色辅助检验,从苏州某食品厂排放的废水中分离筛选出3株反硝化聚磷菌B4、B5和B6。经鉴定,分别属于沙雷菌菌属（Serrat／a）、拉恩菌菌属（Rahnella aquatilis）和不动杆菌菌属（Acinetobacter）。测定了这3株菌的生长曲线,研究了温度和pH值对这3株菌株的生长及脱氮除磷效能的影响。结果表明,B4、B5和B6菌株的生长和脱氮除磷反应最适温度均在30℃左右;在室温条件下,B4、B5和B6生长的最适pH为6．5～8．5;3株菌反硝化脱氮除磷反应的最佳pH值均为中性偏碱。     

端粒缺陷相关因子和人类IgA肾病的关系

研究目的：分析在中国人群中，端粒缩短以及相关衰老因子与人类IgA肾病发生进展的关系。创新要点：目前的研究发现，端粒功能缺陷是限制分裂增殖、细胞衰老的重要分子机制。它不仅仅与衰老相关，而且在疾病的发生、进展过程中都有直接影响。肾脏的正常衰老过程伴随端粒逐渐缩短，端粒功能缺陷可以加速慢性肾脏疾病进程，并伴随相关衰老因子cathelin相关抗菌肽（CRAMP）、延长因子-1α（EF-1α）、几丁质酶（chitinase）和微管不稳定蛋白（stathmin）等表达增加。本项研究首次在中国人群中，揭示端粒缩短以及相关衰老因子与人类IgA肾病发生进展的关系。研究方法：采用双盲法，以IgA肾病患者（n=177）为实验组，以狼疮肾炎（n=50）、糖尿病肾病（n=30）和局灶节段性肾小球硬化（n=30）病人以及健康人（n=83）为对照组，通过定量荧光原位杂交（qFISH）检测了肾脏组织的端粒长度，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了血液、尿液中的CRAMP、EF-1α、stathrnin的含量，运用几丁质酶试剂盒（CS1030）检测了血液、尿液中几丁质酶的酶活性，运用免疫荧光染色检测了组织中CRAMP的表达情况。重要结论：端粒缩短和相关炎症蛋白与IgA肾病的发生发展有关，并为IgA肾病的特异性诊断和及预后评估提供可靠的研究基础。     

Science Letters: Transient expression of chicken alpha interferon gene in lettuce

We investigated the possibility of producing chicken alpha interferon （ChlFN-α） in transgenic plants. The cDNA encoding ChlFN-α was introduced into lettuce （Lactuca sativa L.） plants by using an agro-infiltration transient expression system. The ChlFN-a gene was correctly transcribed and translated in the lettuce plants according to RT-PCR and ELISA assays. Recombinant protein exhibited antiviral activity in vitro by inhibition of vesicular stomatitis virus （VSV） replication on chicken embryonic fibroblast （CEF）. The results demonstrate that biologically active avian cytokine with potential pharmaceutical applications could be expressed in transgenic lettuce plants and that it is possible to generate interferon protein in forage plants for preventing infectious diseases of poultry.     

固定化蜡质芽孢杆菌处理制革废水中Cr(Ⅵ)的条件优化

为了高效去除制革废水中的Cr(Ⅵ),实验采用粉末活性炭包埋蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)制成固定化细胞颗粒,并探讨了该颗粒去除Cr(Ⅵ)的效果。结果表明,在pH值5.0、温度37℃、Cr(Ⅵ)初始浓度小于10mg/L、颗粒用量0.5g/mL左右时,Cr(Ⅵ)去除率较大;在最优条件下,固定化细胞颗粒处理Cr(Ⅵ)的效果比未加菌体的固定化颗粒和Bacillus cereus单独处理时的效果都好。研究表明,固定化Bacillus cereus细胞颗粒可以作为一种新的生物材料,处理制革废水中的Cr(Ⅵ)。     

曙红Y在牛血清白蛋白表面上的Langmuir吸附反应研究

应用微相吸附-光谱修正技术研究了曙红Y(EY)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,并讨论了反应时间、离子强度、温度,以及金属离子干扰等因素对该作用产生的影响.结果表明,EY与BSA间的作用符合Langmuir单分子层吸附,结合产物最大结合数NEY∶NBSA=5∶1;计算了不同温度下(30,45和60℃)反应的结合常数K,发现K随温度的升高而减小;并测定了蛋白质的工作曲线,该方法的检出限为20 mg/L.     

表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚对盐藻的毒性研究

以盐藻作为研究对象,研究脂肪醇聚氧乙烯醚（AE）对盐藻的毒性作用。分别使用含有浓度为0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0mg/L AE的营养液培养盐藻,每日记录细胞总数。在实验的第9d,收集藻液并分别对总谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、铜-锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、可溶性蛋白和叶绿素a含量进行测定。结果表明较高浓度的AE对藻类的生长具有一定的抑制作用;不同浓度的AE处理9d后,各处理组盐藻叶绿素a和T-GSH含量没有显著差异;4.0mg/L AE组盐藻可溶性蛋白含量显著低于对照组和0.25mg/L组（p〈0.05）;0.25mg/L组和4.0mg/L组MDA含量显著低于1.0mg/L组（p〈0.05）;2.0mg/L组和4.0mg/L组盐藻H2O2含量显著低于0.25mg/L组和0.5mg/L（p〈0.05）;AE浓度为0.25mg/L和1.0mg/L组盐藻中CuZn-SOD含量显著低于对照组和0.25mg/L组（p〈0.05）,AE浓度4.0mg/L组盐藻中CuZn-SOD含量显著高于与0.25、0.5、1.0mg/L组（p〈0.05）。证实AE对盐藻具有一定的毒性作用,为活化剂AE的合理使用和安全评价提供了理论依据。     

碳纳米管泡沫体的制备及其对腐植酸的吸附性能

以碳纳米管、聚氨酯发泡剂为主要原料制备出一种新型高效吸附剂,研究了其对天然水中腐植酸的吸附特性.试验中考察了腐植酸溶液pH值与初始浓度、吸附剂用量与吸附时间对吸附过程与效果的影响.试验发现,碳纳米管泡沫体对腐植酸吸附平衡时间约为5 h;在酸性（pH为3.5）及偏酸性条件下（pH为5.5）,1%CNT泡沫体对腐植酸吸附率高;在腐植酸初始浓度低于20 mg/L与在20~40 mg/L时,其吸附率分别为100%和大于80%.研究结果表明,碳纳米管泡沫体是一种新型高效的吸附剂,在酸性与偏酸性条件下对天然水中腐植酸有很好的吸附效果,碳纳米管泡沫体吸附腐植酸符合Langmuir模型.     

“怯气”和“惬气”

“怯气”“惬气”明清小说中常见,词义均同“服气”,“惬”可能是本字,而“怯”是通假字。《鼓掌绝尘》中的“恡气”当校为“怯气”,意为“服气”。虽然“怯气”“惬气”在现代汉语中仍使用较多,但词义都不再是“服气”。