过表达E3泛素连接酶ABRv1通过泛素化CPK3提高拟南芥干旱耐受

拟南芥基因ABRv1编码了一个E3泛素连接酶,其表达量受到干旱胁迫的诱导.为了探究ABRv1功能,我们构建了ABRv1的过表达株系并进行干旱处理,结果显示ABRv1过表达株系OE-3具有90.4%的存活率,ABRv1过表达株系OE-7有88.2%的存活率,野生型Col的存活率则为53.8%,而abrv1突变体仅有7.7%的存活率,说明过表达ABRv1提高了拟南芥对干旱的耐受能力.我们还测定了干旱处理下的失水率,也能得出与上述一致的结论.此外,我们使用纯化的GSTABRv1、His-CPK3蛋白进行了体外pull-down实验和体外泛素化实验,结果证明ABRv1能够和CPK3发生相互作用,ABRv1具有E3泛素连接酶活性并且能够把CPK3单泛素化.结果揭示了ABRv1作为一个正调控因子通过泛素化作用底物CPK3参与了拟南芥的干旱胁迫应答过程.     

水稻中ACOS5同源基因在小穗中的表达分析

ACOS5是控制拟南芥雄性育的关键基因之一,它也是编码花粉素合成必需的酶.利用氨基酸同源序列分析,在数据库中检索与拟南芥ACOS5同源性较高的植物同源蛋白.将检索出的水稻中同源氨基酸序列与ACOS5进行比对,两者一致性为64%.并且通过同源蛋白系统发生分析,两者在进化上关系也较为密切.根据水稻中同源蛋白基因组序列设计引物,进行低温处理下该基因在小花发育各时期的表达量分析.半定量RT-PCR显示,在水稻小孢子母细胞形成期其表达量较低,而当小孢子开始减数分裂时,表达量急剧增高.在这两个时期,低温(20℃)会诱导OsACOSmRNA积累增加;但当处于小孢子形成阶段时,低温下积累量却呈现相反的降低趋势.这说明环境温度显著影响水稻中ACOS5同源基因的转录表达,而这种影响与小花发育时期有关,提示水稻ACOS基因可能参与环境温度调控水稻雄性育性的过程.     

水稻中一个与COI1同源的基因克隆及其表达分析

利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到了几条与拟南芥中的COI1基因具有高度同源性的EST(expression sequence tag)片段和相应的基因组序列．根据EST拼接和基因组比较结果设计引物,利用RT—PCR在水稻中得到与COI1高度同源的cDNA,并在基因组中推断出相应的基因,命名为RCOI1．RCOI1与COI1在氨基酸水平有74％的同源性．与COI1相似,RCOI1蛋白也具有典型的F—box和LRRs结构域．半定量RT—PCR显示该基因的表达受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,说明这个基因可能参与水稻茉莉酸应答反应．该基因的发现对于探索单子叶植物的茉莉酸信号转导途径,以及研究该途径在农作物中的抗虫抗病和抵抗恶劣环境等方面的作用都有重要意义．     

假俭草EoNLA基因克隆与其转基因拟南芥在不同磷水平下的表型鉴定

【目的】磷元素是植物必需的大量营养元素,在植物的生长发育中必不可少。NLA(nitrogen limitation adaptation)蛋白是一种RING型E3泛素连接酶,参与磷转运蛋白的泛素化调控,在植物体的磷素平衡调节方面发挥重要作用。以假俭草这类天然适应低磷土壤条件的植物为研究材料,通过研究假俭草EoNLA的磷高效转运分子机制,为草坪草适应酸性土壤生境的磷高效转运分子育种和栽培调控提供理论依据。【方法】通过RACE方法克隆获得EoNLA基因,应用生物信息学分析确定基因的全长序列及编码氨基酸序列,采用原生质体瞬时表达体系确定EoNLA蛋白膜定位;通过qRT-PCR方法分析EoNLA基因低磷诱导下的表达模式,并通过农杆菌介导转化拟南芥进行基因功能鉴定。【结果】EoNLA基因序列全长1 353 bp,编码一个长度为331个氨基酸的蛋白。该蛋白具有NLA蛋白典型的RING结构域和SPX结构域,EoNLA蛋白定位于细胞膜,EoNLA基因在根组织的表达量显著高于在茎和叶的表达。【结论】EoNLA基因具有根组织表达特异性,且基于拟南芥转基因植株进行的功能鉴定,进一步显示EoNLA基因具有磷素调控相关的功能。     

巴西橡胶树ADP核糖基化因子的鸟核苷酸交换因子基因(HbGNOM)的鉴定与表达

在橡胶树转录组测序的基础上,通过RT-PCR技术扩增得到了橡胶树的一个ADP核糖基化因子的鸟核苷酸交换因子基因(HbGNOM),该基因包含了一个4 410 bp的开放阅读框,编码了一个含1 470个氨基酸的蛋白.生物信息学的分析结果表明:橡胶树HbGNOM蛋白与麻风树、木薯、蓖麻和拟南芥的GNOM蛋白高度相似,相似性分别为97%,96%,95%和84%.半定量分析的结果表明:当橡胶树受到白粉病菌侵染时,HbGNOM基因在叶片中的表达明显升高,但其对炭疽病菌的侵染不产生应答;HbGNOM基因在叶片中的表达可受植物激素乙烯(ET)的诱导,但其对水杨(SA)和茉莉酸(JA)的处理没有明显应答,因此,HbGNOM可能与乙烯信号传导途径有关,并且参与了橡胶树对白粉病的抗病反应.     

水稻胁迫应答基因OsABI8的克隆与表达分析

利用拟南芥abscisic acid-insensitive8(ABI8)基因的序列在NCBI核酸数据库中检索到水稻ABI8的序列信息,并设计特异性引物,以水稻cDNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出水稻ABI8 cDNA序列.将所得序列片段克隆到T载体上并进行序列测定,结果显示,该基因全长1 666 bp,开放阅读框927 bp,编码一个308个氨基酸的蛋白.该蛋白序列与普通小麦、一粒小麦、玉米、高粱、拟南芥菜等植物的ABI8基因序列高度同源,分别达到86.1%、86.4%、89.6%、90.3%及72.5%的一致性.利用荧光定量PCR法检测了QsABI8基因在ABA激素、干旱和盐胁迫下的表达谱,发现胁迫下植物积累更多的QsABI8 mRNA.     

拟南芥 AtTR1 在盐胁迫应答中的功能初探

本研究主要探索油菜中E3泛素连接酶BnTR1在拟南芥中的同源基因AtTR1(At3g47550)的功能.通过体外泛素化实验证明AtTR1具有E3连接酶活性.基因表达分析显示该基因受200mmol/L NaCl显著诱导,说明该基因可能在响应盐胁迫中发挥一定的功能.为了更深入的探究该基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pZH01-AtTR1转化突变体.在含有潮霉素的培养基上筛选阳性苗,并利用荧光定量PCR检测表明AtTR1基因已经成功转入突变体中.     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731(感病系)和C712(抗病系)作为材料,利用cDNA-AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况.获得了两个阳性克隆M2和M6.Nprthern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同.而M6是差异表达的cDNA片段.Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列.随后的序列分析发现M6 cDNA片段与拟南芥1号染色体的BAC F19P19中66 665～66 813 bp有84%同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列.推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91%同源性.用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现:M6 cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24 h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势.根据序列分析和初步的功能分析的结果推测:M6 cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段.是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段.     

诸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析

烯醇式丙酮基莽草酸 3 磷酸合成酶(5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase,EP SPS)是植物和微生物莽草酸途径中的一个必需合成酶,植物中该基因的超量表达或该基因中某些氨基酸突变可以产生对除草剂草甘膦(glyphosate)的耐性.采用5′ RACE技术从诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)叶中克隆出一条长743bp的cDNA片段.序列分析结果表明:该cDNA与其它植物的EPSPS基因具有相当高的核苷酸序列同源性.其所编码的氨基酸序列与欧洲油菜(Brassicanapus)同源性最高为90%,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、西红柿(Lycopersiconesculentum)、烟草(Nicotianatabacum)和水稻(Oryzasativa)的同源性分别为88%,81%,64%,62%和71%.     

一个植物跨膜蛋白DUF872基因家族新成员的克隆与序列分析

DUF872家族是由一些未被具体描述的真核生物蛋白质构成,该家族的基因功能尚不清楚.本研究通过PCR方法从手掌参全长cDNA文库中筛选到了一个DUF872家族基因的全长cDNA,暂命名GcDUF872-1或Gc364.测序表明该序列长度为618 bp,推测编码103个氨基酸的蛋白质,序列比对表明它与拟南芥和水稻的DUF872家族基因蛋白质的相似程度达到85.92%.DUF872基因家族的进化分析表明Gc364与水稻、拟南芥的遗传关系最近,同属一个亚家族.半定量RT-PCR显示Gc364在植物组织中表达量较低,属于低丰度表达的基因,而且表达量受光处理而上调.生物信息学分析表明预测蛋白Gc364属于两次跨膜的蛋白质,可能是一个真正的编码蛋白,主要参与信号传递或能量的转换.     

泛素和PR1a信号肽融合基因植物表达载体的构建

泛素（Ubiquitin）融合蛋白策略在近年来已被应用于在植物中提高外源蛋白的产量。信号肽（Signal Peptide）使外源蛋白定向运输到细胞内的特定部位。本研究是在植物高效表达载体pBin438的基础上，采用三引物PCR法（TP-PCR）技术，将拟南芥（Ambidopsis）泛素基因与烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列体外重组；并将重组的融合基因定向克隆到植物表达载体pBLG中，获得了含有泛素和PR1a信号肽序列的植物表达载体pBLG-UP。这为进一步验证外源基因在植物体内的高效表达奠定了基础。     

大黄鱼LcDCAF17基因的克隆与表达分析

E3泛素连接酶是细胞泛素化过程中的重要因子,DCAF17(DDB1-and CUL4-associated factor between 17 and the like protein)是E3泛素连接酶的底物受体。为了探讨DCAF17蛋白在大黄鱼性腺发育过程中的作用,从大黄鱼转录组数据库拼接出该基因,命名为LcDCAF17。LcDCAF17基因全长1733 bp,开放阅读框1530 bp、编码的蛋白质含509个氨基酸、分子量89.281 ku、等电点5.05。LcDCAF17与其他鱼类的DCAF17同源性较高,达70%以上。荧光定量PCR分析显示LcDCAF17基因在大黄鱼稚鱼、幼鱼、成鱼的各个组织/器官中均有表达,卵巢表达量最高,精巢次之。LcDCAF17在性腺发育过程中表现出逐渐升高的趋势,在成熟期表达量最高,排空期降低。表明LcDCAF17在大黄鱼性腺发育过程中可能发挥着重要的作用。     

多年生簇毛麦基因组Yr10全长同源序列的分离及鉴定

根据植物抗病基因保守结构域NBS(Nucleotide-binding site,核苷酸结合位点)、LRR(Leucine-rich repeats,富含亮氨酸重复)设计13条引物相互组合对多年生簇毛麦基因组总DNA进行PCR扩增,获得了小麦抗条锈病基因Yr10的全长同源序列DbRGAYr10,其序列全长为5615 bp,编码的氨基酸组成与其他已知的普通小麦(Triticum aestivum)、节节麦(Aegilops tauschii)、水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、高粱(Sorghum bicolor)、一粒小麦(Triticum monococcum)基因组内Yr10基因或抗性类似基因编码的氨基酸序列具有89~90%的同源性,且大部分氨基酸序列保守.序列分析表明DbRGAYr10为类NBS-LRR抗病基因,包含TATA-box等顺式作用元件.本研究为最终从多年生簇毛麦中发掘新的抗病基因和开展遗传转化获得新的抗病品种奠定了基础.     

水稻OsICK1基因克隆及其序列分析

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ICK)是一种能够影响细胞生长和发育的重要调控蛋白.以水稻(9311)为材料,利用RT-PCR技术,扩增获得了1个新的可能为水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因,命名为OsICK1.核苷酸序列分析表明,该基因的开放阅读框为585 bp,编码194个氨基酸.与Genbank中预测的水稻ICK基因序列(NM_196964)比对,两者同源性为79.84%;氨基酸序列分析表明,该基因氨基酸序列3′端附近存在植物ICK所固有的保守序列,与玉米ICK1保守序列的同源性高达95.5%.     

短命植物小拟南芥光周期调控基因CONSTANS的克隆与表达特征分析

目的光周期是影响植物生长发育的重要因素之一,CONSTANS (CO)是植物光周期开花途径中关键的基因。方法本研究基于短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)转录组数据库,获得1条与拟南芥CO基因At COL1基因序列高度相似的unigene,通过RT-PCR方法从小拟南芥中克隆了该CO同源基因,命名为Ap COL1;进行了基因的生物信息学分析及节律表达、组织表达和响应非生物胁迫的表达特征分析。结果研究结果表明Ap COL1具有两个Bbox和一个CCT结构域,氨基酸序列上与At COL1相似性高达86. 8%。系统进化分析表明Ap COL1与At COL1和琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)的Al COL1亲缘关系较近,且属于第I亚组成员。qRT-PCR实验表明在长日照和短日照条件下Ap COL1具有相似的昼夜节律表达特征; Ap COL1在小拟南芥各组织中均有表达,但在果荚中表达量最高。250 mmol/L Na Cl胁迫和20%PEG-6000模拟干旱胁迫12 h明显抑制Ap COL1基因的表达,并且随着胁迫时间的延长Ap COL1表达水平没有显著差异。在高温(40℃)胁迫下,Ap COL1基因的表达在24 h内先下降后上升并达到最高,48 h又下降到对照水平。低温(4℃)胁迫24 h之前,Ap COL1基因的表达没有明显变化,但处理48 h表达水平显著下降。结论本研究表明Ap COL1基因能够响应盐、干旱、高温和低温等非生物胁迫,暗示该基因在小拟南芥抵抗逆境胁迫中起着重要作用。     

UV-B预处理对拟南芥uvr8-2突变体响应干旱胁迫的影响

以拟南芥uvr8-2突变体植株为材料,研究UV-B预处理对植株响应干旱胁迫的影响以及植物激素在此过程中的作用.实验结果表明:从形态观察到生理指标,UV-B预处理显著提高了拟南芥uvr8-2突变体的干旱适应性,与野生型Ler的结果一致; UV-B预处理显著提高了拟南芥uvr8-2突变体抗氧化酶SOD、POD、CAT活性,抗氧化酶基因POD和CAT的表达量,以及植物激素ABA、JA、SA的质量分数,降低了细胞膜受损程度.由此推测:UV-B预处理诱导uvr8-2植株的干旱适应性中存在一条不依赖于UVR8的信号转导途径,即通过增加植物逆境响应激素ABA、JA和SA的质量分数,调控抗氧化酶基因CAT和POD表达和增强抗氧化酶活性,从而缓解干旱胁迫下拟南芥的叶片萎焉、相对含水量下降等现象.     

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

为确定桃树细胞质抗寒相关基因,依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因,结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp,编码513个氨基酸;结构域分析显示,该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域,是与拟南芥RBD1同源的蛋白;亚细胞定位预测表明,该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。     

依纽小单胞菌2-脱氧蟹肌醇合成酶基因的克隆与表达

从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)扩增参与紫苏霉素生物合成的2-脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB,并分别将其克隆到筛选载体pUC18和表达载体pET-30a上,其开放阅读框长1 185 bp,编码含394个氨基酸残基(41.94 ku)的多肽链,将pET-sisB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),使sisB基因实现表达.基因sisB的碱基序列与棘孢小单孢菌(M.echinospora)的基因gntB的碱基序列的同源性高达93%.预测的SisB蛋白序列与GntB蛋白序列的同源性为95.2%.基因sisB是继紫苏霉素抗性基因srm1(AY661430)和参与紫苏霉素生物合成的糖基转移酶基因sisD(DQ250992)和sisZ(DQ250994)后,从依纽小单孢菌克隆到的又一新基因.该基因在GenBank的接受号为DQ250993.     

提高番茄品质的番茄去泛素化酶基因AMSH3

AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM蛋白酶家族的一员,能结合泛素化蛋白上的泛素分子。文章在番茄中发现了一去泛素化酶基因SlAMSH3,与拟南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分别有81%和71%的相似性。拟南芥中去泛素化酶AtAMSH3会影响植物液泡的形成和液泡蛋白的运输途径。文章构建了SlAMSH3果实特异表达的过表达载体,并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,通过筛选获得SlAMSH3在果实中高表达阳性株系,实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分析显示,转基因番茄果实中SlAMSH3的表达量明显高于野生型果实(p0.05)。文章测定了阳性番茄株系绿熟期果实叶绿素质量浓度及红熟期果实的单果质量、果实糖度、果实硬度、番茄红素质量浓度和β-胡萝卜素质量浓度。结果表明,转基因番茄果实的叶绿素总质量浓度、番茄红素和β-胡萝卜素比野生型分别提高178.61%、40.53%和74.86%,其他指标无显著差异。因此,SlAMSH3果实特异过表达的方法能够改良番茄果实品质,为基因工程方法改良番茄果实品质做出了新尝试。