猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

牦牛乳腺上皮细胞的体外培养的研究

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牦牛乳腺上皮细胞．形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征．染色体数目分析表明,细胞核型稳定,在离体培养条件下不发生转化．牦牛乳腺上皮细胞染色体数目为60,染色体组型为2n=60．     

绿色荧光蛋白基因在牦牛乳腺上皮细胞中表达的研究

从牦牛乳腺采集组织, 并通过胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法相结合在体外成功分离、纯化到了牦牛乳腺上皮细胞. 通过观察, 具有明显的上皮细胞特征, 而且符合一般细胞的生长规律. 通过脂质体介导法将携带有绿色荧光蛋白的外源基因转染进乳腺上皮细胞中, 在荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白基因的表达.     

体外培养人涎腺多形性腺瘤细胞及表面标记物的初步研究

体外培养15例人涎腺多形性腺瘤原发肿瘤组织,探讨体外培养的细胞与原发肿瘤组织的表面标志物表达情况。运用免疫组化法检测CK5/6、CK7、CK8/18、CK14、CK20,vimentin及肌上皮表面标记物α-SMA、calponin及p63在细胞和肿瘤组织中的表达。结果发现体外培养的多形性腺瘤细胞呈多样形,可同时表达角蛋白、肌上皮表面标记物及波形蛋白,与原发肿瘤表达基本一致。提示体外培养的多形性腺瘤细胞可能大部分来源于肌上皮细胞及导管上皮细胞等,这为研究涎腺多形性腺瘤肿瘤生物学多样性提供了实验依据。     

树鼩小肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定

目的从树鼩小肠分离小肠上皮细胞,探索分离培养方法和条件,为药物开发和病原感染机制研究提供体外细胞模型,并且为建立树鼩小肠上皮细胞系奠定基础。方法采用胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ及DTT联合消化树鼩小肠组织块,得到的细胞经完全培养液培养,用相差显微镜观察细胞形态,通过MTT法测定细胞生长曲线,并采用细胞角蛋白荧光染色等方法鉴定细胞。结果经优化分离法得到的肠上皮隐窝细胞团在24 h后贴壁,6 d汇合成片,在显微镜下观察发现细胞团延辐射状向外长出铺路石样和多角状的细胞;第二代后,每隔2~3 d可传代1次;细胞接种3~6 d为对数生长期;细胞角蛋白18进行免疫荧光鉴定后确定为小肠上皮细胞。结论本实验成功地从树鼩小肠分离到了小肠上皮细胞,并且建立了树鼩小肠上皮细胞体外培养的方法。     

小鼠胎肺Ⅲ型上皮细胞的分离纯化及原代培养

用免疫黏附和差速离心法分离和纯化小鼠胎肺Ⅱ型细胞,所得细胞纯度达(90±2)%,产量为每5只小鼠胎肺收获(23.6±7)×106个细胞.原代培养的小鼠胎肺Ⅱ型细胞在12～24 h 开始贴壁,在36～48 h呈指数生长,72 h后生长减缓,4～5 d左右细胞开始变形分化.免疫荧光鉴定胎肺Ⅱ型细胞表面活性蛋白C(SP-C)染色阳性,透射电镜观察到细胞内板层小体,细胞中proSP-C蛋白在培养48 h后表达较高.体外病毒转染成功,可见强烈荧光表达.成功建立了小鼠胎肺Ⅱ型上皮细胞的培养模型.     

人良性前列腺增生组织中基底细胞去分化与雌激素受体α表达的关系

雌激素效应增强在良性前列腺增生(BPH)发生发展中发挥了重要作用.收集20例BPH和10例正常前列腺(NP)组织标本,采用免疫组化染色和免疫荧光方法研究良性前列腺增生组织中上皮细胞角蛋白(CK)、非肌型肌球蛋白(NMMHC)、增殖细胞核抗原(PCNA)和雌激素受体α(ERα)的表达及其定位关系.结果表明,与NP相比,在BPH组织基底细胞中与干/祖细胞相关的CK14和CK5以及与去分化相关的NMMHC和ERα的表达明显增加;而且CK14、NMMHC和ERα有共定位的关系.BPH组织中部分基底细胞去分化为干性细胞;雌激素效应增加使基底细胞发生去分化是BPH发生和发展的重要机制.     

IGF-I、HGF、TGF-β1、IFN-γ对奶牛乳腺上皮细胞增殖活性的影响

研究胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、干扰素-γ(IFN-γ)对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖的调节作用。应用组织块培养和差速消化法获取原代奶牛乳腺上皮细胞,免疫荧光鉴定正确后MTT法评价不同浓度的4种细胞因子对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖的影响。IGF-I、HGF分别在10~200 ng/m L,0.1~100 ng/m L浓度范围内对乳腺上皮细胞的增殖呈正相关。而TGF-β1(2.5~100 ng/m L)、IFN-γ(5~160 ng/m L)则剂量依赖性地抑制乳腺上皮细胞增殖。IGF-I、HGF均能促进奶牛乳腺上皮细胞的体外增殖,该作用在一定浓度范围内有剂量依赖性;TGF-β1、IFN-γ对乳腺上皮细胞的增殖作用出现剂量抑制效应。该研究为下一步深入探讨细胞因子对奶牛泌乳机制的研究奠定基础。     

钾通道阻断剂对人乳腺上皮细胞MCF10A增殖的影响

探讨电压门控钾离子通道在乳腺上皮细胞增殖过程中的作用.通过MTT法检测了钾通道阻断剂TEA、电压门控钾通道阻断剂4-AP对人乳腺上皮细胞MCF10A增殖的影响并与乳腺癌细胞MCF7作了比较,免疫印迹方法观察了电压门控钾通道Kv1.2、Kv1.5的表达.研究发现,两种钾离子通道阻断剂对人乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖的影响均呈剂量依赖性关系.经5 mmol/L TEA 处理72 h后,MCF10A细胞的生长抑制率为21.67%,而MCF7细胞的生长抑制率为41.36%;5 mmol/L 4-AP处理72 h后,MCF10A的生长抑制率为29.24%,而MCF7细胞的生长抑制率为40.24%.Kv1.2在MCF10A和MCF7中表达没有变化,而Kv1.5在MCF10A细胞中的表达明显高于MCF7细胞.提示电压门控钾离子通道在乳腺细胞的增殖中起重要作用,其中Kv1.5 可能和乳腺细胞的转化密切相关.     

小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型,试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。先采用机械分离方法分离子宫平滑肌,再用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法消化,可获得90%以上具有正常代谢活性的小鼠子宫平滑肌细胞,存活的细胞经倒置显微镜观察和免疫荧光染色进行鉴定。原代培养3d后细胞贴壁生长,约2周后细胞汇合成片,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型"峰-谷"样生长,平滑肌细胞肌动蛋白(α-Actin)免疫荧光染色强阳性。采用本法体外培养的小鼠子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于小鼠子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究。     

钾通道阻断剂对人乳腺上皮细胞MOF10A增殖的影响

探讨电压门控钾离子通道在乳腺上皮细胞增殖过程中的作用．通过MTT法检测了钾通道阻断剂TEA、电压门控钾通道阻断剂4-AP对人乳腺上皮细胞MCF10A增殖的影响并与乳腺癌细胞MCF7作了比较,免疫印迹方法观察了电压门控钾通道Kv1．2、Kv1．5的表达．研究发现,两种钾离子通道阻断剂对人乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖的影响均呈剂量依赖性关系．经5mmol／LTEA处理72h后,MCF10A细胞的生长抑制率为21．67％,而MCF7细胞的生长抑制率为41．36％;5mmol／L 4-AP处理72h后,MCF10A的生长抑制率为29．24％,而MCF7细胞的生长抑制率为40．24％．Kv1．2在MCF10A和MCF7中表达没有变化．而Kv1．5在MCF10A细胞中的表达明显高于MCF7细胞．提示电压门控钾离子通道在乳腺细胞的增殖中起重要作用,其中Kv1．5可能和乳腺细胞的转化密切相关．     

5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮抑制人乳腺癌细胞生长和诱导凋亡的作用

目的 探讨金雀异黄素（Genistein,Gen）衍生物5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮（5,4’-Di-n- octoxyl-7-gem-difluoromethylene-genistein,DOdFMG）体外抑制人乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长和诱导凋亡作用及机制,以寻找具有开发前景的肿瘤治疗新候选药物.方法 体外培养人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞,分别应用不同浓度的DOdFMG处理人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞,软琼脂克隆形成法测定DOdFMG对体外培养MCF-7细胞的锚定非依赖性增殖及生长作用的影响;PI染色流式细胞计分析（FCM）法检测DOdFMG对MCF-7细胞诱导凋亡影响.western blotting法检测蛋白激酶CK2,NF-KB蛋白表达和活性的变化,初步探讨DOdFMG抗乳腺癌作用的分子机制.结果 DOdFMG对体外培养MCF-7细胞具有抑制增殖及生长作用,呈剂量依赖性.DOdFMG诱导人MCF-7细胞凋亡.Western Blot分析结果显示：DOdFMG 3.0,10.0,30.0 μmol/L处理人乳腺癌MCF-7细胞24 h后,比较于空白对照组,蛋白激酶CK2的表达下调12.50%,41.50%,67.30%,NF-KB的表达下调20.50%,51.47%,71.93%.DOdFMG 30.0 μmol/L分别处理6,12,24 h后,比较于空白对照组,蛋白激酶CK2的表达下调27.73％,44.8％,65.2％,NF-KB的表达下调20.50%,49.83%,69.93%.这表明DOdFMG以时间－剂量依赖方式引起蛋白激酶CK2、NF-KB下调,与先导化合物Gen比较,DOdFMG更为有效（P<0.05）.结论 DOdFMG显著抑制人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞增殖及生长;DOdFMG可诱导人乳腺癌细胞系（MCF-7）细胞凋亡;抑制蛋白激酶CK2,下调NF-κB的表达可能是DOdFMG诱导凋亡的分子机制之一.     

树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。     

外周血内皮祖细胞在去细胞猪主动脉瓣膜上种植的体外观察

为在体外观察外周血内皮祖细胞种植到去细胞猪主动脉瓣上的生长情况.采用TritonX-100联合胰蛋白酶、核酸酶去除猪主动脉瓣膜细胞.从志愿者外周血中分离培养内皮祖细胞,免疫荧光鉴定细胞后.将从外周血培养的EPC种植到去细胞猪主动脉瓣膜上,用HE、免疫组化染色和免疫荧光染色观察种植效果.结果显示猪主动脉瓣内的细胞去除彻底,但纤维支架保存良好.人外周血培养出的细胞,免疫荧光染色示ac-LDL和UEA-1阳性,提示为内皮祖细胞,种植后行HE染色可见到去细胞猪主动脉瓣膜表面单层内皮细胞生长,并且表达von Willebrand因子和CD31.     

红景天苷对BMSC生物学特性影响

目的：研究红景天苷对骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells,BMSCs）生物学活性影响。方法：采用贴壁法分离培养BMSCs,检测细胞表面分子表达对所获干细胞进行鉴定。以终浓度为10¨g／mL红景天苷与BMSCs共培养,通过形态学观察和MTT法分析研究其对BMSCs生物学特性影响。结果：成功培养出BMSCs,免疫荧光染色显示,培养的第3代BMSCs表达CD29、CD44干细胞标志。10μg／mL红景天苷与BMSCs共培养后,较对照组细胞生长更为旺盛,更为规整,形成典型的“鱼群状”。生长曲线显示,实验组细胞较对照组生长稳定,增殖能力活跃。结论：10μg／mL红景天苷可促进BMSCs增殖分化,又不影响细胞增殖分化等生物学特性。     

PCBP1基因RNAi序列的鉴定及其干扰效应的初步研究

以能与PCBP1mRNA特异结合的核苷酸片段(21个碱基对)构建shRNA真核表达载体并稳定转染Hela细胞,通过半定量RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光实验证实转染细胞中PCBP1的mRNA水平和蛋白质表达水平均被显著抑制.接着,本研究通过测定稳定转染Hela细胞的生长曲线、血清依赖性生长曲线和软琼脂集落形成率,证明PCBP1的沉默能够显著抑制细胞的生长增殖能力以及克隆形成潜能,揭示PCBP1可能直接或间接参与细胞周期的调控.本研究成功鉴定了沉默PCBP1基因表达的有效干扰片段,为下一步利用该有效干扰片段进行体内研究奠定了基础.同时,本研究的结果将有助于深入认识PCBP1蛋白在细胞周期调控和细胞癌变中的作用机制.     

上皮性钙通道TRPV6对乳腺分化发育的影响

为了研究上皮性钙通道TRPV6(transient receptor potential vanilloid 6)对乳腺分化发育的影响,本实验首先收集了发育不同时期的小鼠乳腺样本,共11个时间点,包括青春前期、青春期、孕期、泌乳期以及退化期,通过免疫荧光染色的方法观察了TRPV6在乳腺发育过程中的表达变化.其次,利用3维培养技术、Real-time PCR技术以及免疫荧光技术探究了TRPV6对正常乳腺上皮细胞MCF10A分化的影响.结果表明,在乳腺发育的不同阶段,TRPV6的表达水平具有明显差异,且在泌乳期达到最高;敲减TRPV6可以显著抑制MCF10A乳腺微球的形成,表现在成球数量的减少和微球平均直径的下降;在RNA和蛋白水平的检测结果显示TRPV6的敲减影响多个细胞分化相关分子的表达.上述结果提示TRPV6在乳腺发育过程中可能发挥重要作用.     

HeLa/GFP-H2B 细胞系的构建及对其有丝分裂进程的动态观察

准确的染色体分离依赖于有丝分裂过程的精确调控,包括有丝分裂的时间,及纺锤体检查点的正确调控等。通过动态观察有丝分裂染色体的运动可对上述研究进行精确定量。结果显示,利用逆转录病毒系统成功构建了稳定融合表达绿色荧光蛋白GFP—H2B的HeLa细胞系,结合细胞同步化方法,建立了一套利用活细胞荧光共聚焦显微镜观察HeLa细胞有丝分裂的实验体系。     

Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动态定位

准确的染色体分离依赖于有丝分裂过程的精确调控,包括有丝分裂的时间,及纺锤体检查点的正确调控等。通过动态观察有丝分裂染色体的运动可对上述研究进行精确定量。结果显示,我们利用逆转录病毒系统成功构建了稳定融合表达绿色荧光蛋白GFP-H2B的HeLa细胞系,结合细胞同步化方法,建立了一套利用活细胞荧光共聚焦显微镜观察HeLa细胞有丝分裂的实验体系。