构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的：构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体（Fms—like tyrosine kinase 3 ligand,Fh3L）胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：依据Fh3L基因序列设计引物,以RT—PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Fh3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果：克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21（ED3）中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量（Mr）为19000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论：成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

人可溶性TRAIL原核分泌表达载体的构建

为了克隆人可溶性TRAIL基因片段,构建其新型原核分泌表达载体,从HL-60细胞中提取总RNA,根据GeneBank提供的人TRAIL基因序列,设计扩增人可溶性TRAIL基因114～281片段的特异性引物,同时引入NcoI、BamHI、TEV酶的酶切位点及His标签,以便纯化及纯化后切去His标签,并将目的基因克隆至原核表达载体PhoA,经测序分析鉴定,于大肠杆菌MM294中进行表达.结果表明:克隆到人sTRAIL基因序列,经DNA测序结果与GeneBank基因库报道的一致,成功构建了可分泌表达的人源可溶性TRAIL原核表达载体PhoA-sTRAIL,并在大肠杆菌MM294中成功表达.     

重组拟南芥细胞色素P450 707A3在大肠杆菌中的原核表达

拟南芥细胞色素P450 707a基因是编辑脱落酸8-羟化酶的基因,克隆其中的cyp707a3基因并构建表达载体p CWori(+)-cyp707a3,在E.coli Rosseta菌株中原核表达并得到了具有活性的酶蛋白.结果显示:大部分酶蛋白定位于大肠杆菌细胞膜.     

构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.     

大肠杆菌系列融合表达载体的构建

许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子(IF2-I)、氮源利用物质A(NusA)和谷胱甘肽转移酶(GST)以及3种伴侣蛋白(GroEL、DnaK和TF)分别克隆至pET30a(+),构建了系列融合表达载体.这些载体含有相同的克隆位点以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因hRnBP克隆到mMBP融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,TEV酶切获得了预期的带型.全细胞偶联生成N-乙酰-D-神经氨酸实验发现mMBP-hRnBP的摩尔转化率较无mMBP标签的体系提高了近60%,证明了融合表达载体中融合标签的适用性.新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择.     

AtGT-3b基因克隆及原核表达与纯化

GT-3b转录因子是一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element( GAAAAA)相互作用,促进下游基因的表达,在植物耐盐中起着重要的调节作用.通过分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGT-3b基因,克隆到原核表达载体pCold TF中,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行融合表达;通过纯化得到AtGT-3b融合蛋白,以期用于研究其与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用.     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建

胰岛素样生长因子结合蛋白7（简称IGFBP7）广泛存在于多种正常的组织中，但在相应的肿瘤细胞中的含量极微。试验表明，它在肿瘤发生的不同阶段抑制其生长。采用RT－PCR和Nest-PCR方法，从正常的小鼠脾脏中扩增得到IGFBP7 cDNA片段，测序正确后，克隆于融合表达载体pRSETC中构建原核表达重组体。     

编码拟南芥含BAG结构域蛋白的原核表达载体构建

生物信息学分析显示,拟南芥基因At5g62390编码一种钙调素结合蛋白,在其钙调素结合结构域有一个BAG(Bcl-2-associated athnogene)结构域存在,与钙调素结构域部分重叠.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特征及BAG结构域在钙调素结合中可能的调节作用,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增不同结构域编码区的cDNA序列,构建到原核表达载体pET32-a中.测序分析表明:目的序列已正确克隆到表达载体上,为进一步表达目的蛋白及其不同结构域用于生化功能鉴定打下了基础.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

克隆出大肠杆菌编码葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的 gcd 基因,构建了诱导型表达载体pET28a-gcd,转化大肠杆菌E. coli BL21后获得阳性克隆菌株BL21/pET28a-gcd。IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析表明,该工程菌PQQGDH的表达量约为对照菌的18倍,约为18.2 mg/L,实现了高表达。此外,研究发现添加MgCl₂能提高PQQGDH的表达量。     

人超氧化物歧化酶-过氧化氢酶融合基因的构建、表达及其产物的初步纯化和性质研究

尝试应用基因工程技术制备一种兼具人超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的双功能融合蛋白CAT-PTD-SOD,其中的PTD是序列为RKKRRQRRR的短肽.首先通过重叠PCR构筑CAT-PTD-SOD融合基因,然后把该基因转化进入大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)菌株.通过SDS-PAGE、CAT和SOD活性分析以及分离纯化组分的分析确认该重组菌株能够表达CAT-PTD-SOD,其表达量可达总蛋白的8.9%,SDS-PAGE显示其分子量约为85 kD.可溶性实验发现该融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在.抗H2O2能力实验表明CAT-PTD-SOD具有很好的抗H2O2能力,在0.033 mol.L-1、甚至0.067 mol.L-1的H2O2溶液中,其SOD活性20 min内无明显下降.     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究

构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒pcDNA3.1( )/tPA,并研究其有无生物学活性.用RT-PCR法从人心脏组织中克隆tPA基因并将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,对pcDNA3.1( )/tPA进行酶切鉴定和测序.脂质体介导pcDNA3.1( )/tPA转染血管平滑肌细胞,分别用Nothern Blot和斑点印迹法从mRNA和蛋白质水平检测tPA的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性.成功克隆了人tPA基因并构建了pcDNA3.1( )/tPA真核表达质粒,pcDNA3.1( )/tPA转染VSMC后,tPA mRNA和蛋白质表达增加,所表达的tPA蛋白质具有纤溶活性.     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ,并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下,ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。