一种筛选高产(+/-)-γ-内酰胺酶菌株方法的建立

(+)-γ-内酰胺酶能够拆分(+/-)-γ-内酰胺得到(-)-γ-内酰胺,(-)-γ-内酰胺酶能够拆分(+/-)-γ-内酰胺得到(+)-γ-内酰胺。目前只有几种具有(+/-)-γ-内酰胺酶的微生物被报道,都是用N-乙酰-L-苯丙氨酸做为唯一碳源从土壤里筛选能利用N-乙酰-L-苯丙氨酸的菌株,它们有可能具有(+/-)-γ-内酰胺酶,再用手性高效液相色谱分析法复筛。但是这种筛选方法有点盲目性,工作量大。本实验在此基础上,先利用经典的复制平板和茚三酮染色技术,再用氨基酸显色法复筛得到3株阳性菌株,最后用手性高效液相色谱分析法确认。结果筛选到的3号菌株具有(+)-γ-内酰胺酶功能,ee值达到100%,22号和29号菌株具有(-)-γ-内酰胺酶功能,ee值达到50%。此种筛选方法的建立,以后也可用于类似的易溶,又不显色底物的降解菌株和阳性克隆子的筛选。     

一株产(-)γ-内酰胺酶的Pantoea Ananatis Y22筛选及全细胞转化(+/-)γ-内酰胺

利用(+/-)γ-内酰胺做为唯一碳源从土壤中分离出一株能产生(+)γ-内酰胺酶水解拆分(+/-)γ-内酰胺的菌株.鉴定菌株为Pantoea ananatis Y22.进一步优化了P.ananatis Y22发酵产γ-内酰胺酶的发酵条件和生物转化条件.发现棉子糖为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源;Y22在pH值4～10范围内生长良好,最佳发酵pH值为7,最佳生物转化pH值为8.确定最佳发酵温度为30℃,最佳生物转化温度为30℃.     

新德里金属-β-内酰胺酶-1的结构、催化机理及其抑制剂研究进展

β-内酰胺类抗生素,作为一线抗生素被广泛用于各类细菌感染的临床治疗.由位于质粒的基因blaNDM-1编码的新德里金属-β-内酰胺酶-1可高效水解几乎所有β-内酰胺类抗生素,对β-内酰胺类抗生素的应用造成了极大的威胁,开发有效的抑制剂新德里金属-β-内酰胺酶-1抑制剂迫在眉睫.而抑制剂分子的设计改造工作的开展有赖于对新德里金属-β-内酰胺酶-1结构和催化功能的研究,本综述旨在总结目前有关新德里金属-β-内酰胺酶-1结构、催化机理及其抑制剂的相关研究进展,为基于新德里金属-β-内酰胺酶-1结构的药物分子设计、改造等研究提供帮助.     

亚磷酰胺配体-铱催化不对称氢化反应构建手性γ-内酰胺

正γ-内酰胺是一类重要的结构单元,广泛存在于许多天然产物、药物以及其它具有生物活性的分子结构中。研究表明,γ-内酰胺类化合物在抗菌、抗肿瘤、抗HIV及抗老年痴呆等许多方面都有很好的应用。由于独特的生物活性和用途,γ-内酰胺结构也是合成化学中构建一些复杂分子的关键合成砌块。近年来关于γ-内酰胺的合成方法被大量的报道,如     

大肠埃希菌ESBLs检测及其耐药性分析

目的探讨本地区大肠埃希菌分离株中超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的阳性率及产酶株对β-内酰胺类抗生素的耐药性。方法采用双纸片协同法检测菌株的ESBLs,并用Kirby-Bauer法检测了415株产ESBLs的大肠埃希菌对16种β-内酰胺类抗生素的耐药性,并对其标本来源和病区分布进行了分析。结果ESBLs总检出率为50．8％,其中ESBLs检出率较高的科室为普外科、脑外科、肾内科、骨科、呼吸内科。所有大肠埃希菌分离株均对Imipenem和Meropenem敏感。产ESBLs株对其他14种β-内酰胺类抗生素的耐药性均高于非产酶株。结论本地区ESBLs检出率较高,分布科室有特殊性,产ESBLs株对抗生素的耐药性高于非产酶株。     

产β-内酰胺酶伤寒杆菌与痢疾杆菌blaTEM耐药基因研究

目的:研究新余市产β-内酰胺酶伤寒杆菌与痢疾杆菌blaTEM-1D型耐药基因流行特征。方法:收集新余新钢中心医院、新余市人民医院、新余市中医院、新余市妇幼保健院2008年1月—2010年6月分离出的伤寒杆菌产酶株6株和痢疾杆菌产酶株13株共19株,用头孢哨噻吩滤纸片法做β-内酰胺酶的定性检测,确定为产酶株后,采用PCR技术扩增质粒blaTEM-1D耐药基因,用Mark标记量出扩增子的大小(bp),统计blaTEM-1D耐药基因阳性率。结果:伤寒杆菌、痢疾杆菌产酶株blaTEM-1D耐药基因阳性率分别为66.7%(4/6)、76.9%(10/13)。结论:blaTEM-1D型耐药基因在本地区各家医院间存在水平传播和医院内垂直传播。     

肠杆菌科细菌耐药基因NDM和ESBLs的检测及白头翁汤增强其敏感性研究

采用美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的方法，检测了临床分离的44株肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum Beta-Lactamases, ESBLs)的情况.利用PCR对临床分离菌进行新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase, NDM)以及ESBLs耐药基因的检测.用微量肉汤稀释法测定了分离菌对阿莫西林等14种抗菌药的敏感性，并统计其耐药率.结果表明，临床分离的44株肠杆菌科细菌中，有31株产超广谱β-内酰胺酶，检出率为70.5%.耐药基因检测结果显示，耐药基因NDM-1携带率为13.6%.ESBLs耐药基因TEM,SHV,CTX-M,OXA的携带率分别为100%,43.2%,45.5%,6.8%.同时发现，有6株菌株同时检出了含NDM-1和ESBLs的基因，有9株菌株同时检出含有2种ESBLs基因，3株同时检出含有3种ESBLs基因.敏感性测定结果显示，分离菌大多呈现多重耐药，分离菌除对替加环素(18.2%)和阿米...     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

三氯化铁催化的羟基亲核取代的碳碳键形成反应（英文）

三氯化铁能够有效地催化吲哚取代γ-羟基内酰胺中羟基形成新的C-C键.反应可能是通过N-酰亚胺离子历程进行.该反应能够在短时间内形成高产率的γ-取代内酰胺,反应条件温和,稳定性好,可规模放大.     

产β-内酰胺酶气单胞菌检测及耐药性分析

目的:检测从临床标本中分离的185株气单胞菌对10种抗菌药物的体外活性,及这些菌产AmpC酶、金属β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶的情况,指导临床正确合理使用抗生素。方法:用API-20NE和API-20E及补充生化试验对菌株进行鉴定;采用MIC法检测超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶;改良Hodge试验检测金属β-内酰胺酶;MIC测定采用琼脂稀释法。结果:气单胞菌的产酶率为9.3%(19/185),其中AmpC酶为1.6%(3/185),金属β-内酰胺酶为2.7%(5/185),超广谱β-内酰胺酶为6.5%(12/185)。氨苄西林敏感性低,三代头孢菌素和氨基甙类的敏感率在80%左右,四代头孢菌素、亚胺培南和氟喳诺酮类敏感率大于90%。结论:实验室有必要加强对产β-内酰胺酶气单胞菌的检测。氟喹诺酮类是治疗气单胞菌感染的首选药物,其次为氨基甙类。     

解酯耶氏酵母产γ-癸内酯的研究进展

介绍了微生物通过β-氧化转化蓖麻油酸产生γ-癸内酯的机理和国内外对解脂耶罗维亚酵母在产γ-癸内酯方面的一系列相关研究进展,同时介绍了本研究组应用同源重组基因敲除和自克隆技术对解脂耶罗维亚酵母进行的某些基因遗传改良工作,通过本研究组的工作,应用解脂耶罗维亚酵母生产γ-癸内酯的量有了更大提高.探讨了高产γ-癸内酯酵母菌株的构建思路,以期有助于今后的研究工作.     

自锚定 β-内酰胺酶荧光探针

利用活性醌亚甲基发展了一个能够选择性标记β-内酰胺酶的荧光探针CFC-4,而β-内酰胺酶的产生是致病菌对临床中大量应用的β-内酰胺抗生素产生耐药性的一个主要原因.该探针从头孢原料GCLH出发,经过6步反应合成得到.经过一系列酶、菌标记等实验证明,这一荧光探针可以在β-内酰胺酶的作用下荧光强度增强170余倍,并实现对β-内酰胺酶以及表达β-内酰胺酶的大肠杆菌的荧光标记.更重要的是,这个探针与之前报道的标记型探针CFC-2相比具有更高的荧光标记效率和荧光强度,对于耐药病菌的快速检测具有较好的应用价值.     

产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌的耐药性监测

目的：探讨大理地区产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌的耐药情况。方法：采用VITEK-32型全自动微生物鉴定仪将葡萄球菌属鉴定到种，头孢硝噻吩滤纸片法检测β-内酰胺酶，药物敏感试验采用K-B法。结果：61株金黄色葡萄球菌中产β-内酰胺酶13株，产酶率21．3％，产酶株对万古霉素最敏感，其次为左氧氟沙星，对其他抗生素的耐药率前四位分别是氨苄西林92．4％，青霉素G92-4％，红霉素84．7％，克林霉素69.3％。结论：金黄色葡萄球菌的β内酰胺酶检测应作为常规项目开展，产β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌对青霉素类，大环内酯类抗生素高度耐药，万古霉素无耐药菌株，为首选药物，应在药敏试验指导下合理选用抗生素。     

中药原液制备方法对产酶菌抑菌效果的影响

采用煎煮法、加水研磨法、蒸馏法制取黄芩、黄连、鱼腥草中药原液,利用平板稀释法对产β-内酰胺酶葡萄球菌菌株进行了体外抑菌试验。结果表明：用煎煮法提取的黄连和黄芩原液对产β-内酰胺酶葡萄球菌菌株的最小抑菌浓度（M IC）分别为7.81 mg/mL、31.25 mg/mL;加水研磨法提取的黄连原液对产β-内酰胺酶葡萄球菌菌株的M IC为62.50 mg/mL;蒸馏法制备的3种中药原液、煎煮及加水研磨法制备的鱼腥草原液、加水研磨法制取的黄芩原液对产β-内酰胺酶的葡萄球菌均没有抑菌作用。     

铜绿假单胞菌PA0057基因的克隆、表达及其重组蛋白活性的初步研究

铜绿假单胞菌PA0057基因为Ⅳ类未知基因,通过NCBI比对,发现PA0057基因编码的蛋白与金属β-内酰胺酶同源性为96%,因此推测PA0057蛋白可能具有金属β内酰胺酶活性.提取铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA,利用设计的引物通过PCR方法扩增得到PA0057基因,将其克隆至克隆载体pGEM-T,并转化人大肠杆菌DH5α;而后将其克隆至表达载体pET28a中,转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,并通过Ni-NTA亲和柱进行纯化,纯化后蛋白超滤浓缩得高浓度蛋白;通过药敏纸片检测PA0057蛋白活性.     

铜绿假单胞菌PA0057基因的克隆、表达及其重组蛋白活性的初步研究

铜绿假单胞菌PA0057基因为Ⅳ类未知基因,通过NCBI比对,发现PA0057基因编码的蛋白与金属β-内酰胺酶同源性为96%,因此推测PA0057蛋白可能具有金属β内酰胺酶活性.提取铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA,利用设计的引物通过PCR方法扩增得到PA0057基因,将其克隆至克隆载体pGEM-T,并转化人大肠杆菌DH5α;而后将其克隆至表达载体pET28a中,转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,并通过Ni-NTA亲和柱进行纯化,纯化后蛋白超滤浓缩得高浓度蛋白;通过药敏纸片检测PA0057蛋白活性.     

产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及耐药性分析

按美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005年制定的标准方法,筛选产超广普β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)的大肠埃希菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia),并采用微量肉汤稀释法,对宁夏地区以上2种细菌产ESBLs的耐药情况进行了检测.发现63株大肠埃希菌和41株肺炎克雷伯菌中,45株为产ESBLs菌,总阳性率为43.27%,其中,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌阳性率分别为53.97%(34株)和26.83%(11株).45株产ESBLs菌对美罗培南的敏感率为100%.对头孢他啶的敏感率为76.47%,而对其他抗菌药物敏感率较低.实验证明,宁夏地区产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性严重,应限制广谱β-内酰胺类抗生素,特别是第3代头孢菌素的使用.从目前耐药性监测来看,美罗培南可作为治疗产ESBLs菌严重感染的有效药物.     

手性诱导试剂(S)-(+)-2-苯胺甲基吡咯烷的合成

采用新的合成路线,以L-谷氨酸为原料,通过内酰胺环化、离子交换树脂分离、苯胺酰胺化、AlLiH4还原等一系列反应,合成手性诱导试剂(S)-(+)-2-苯胺甲基吡咯烷,经元素分析、质谱和核磁共振谱等对产物的结构进行了确证.该反应具有条件温和、后处理操作简单、产率较高等优点.     

肠杆菌科细菌产AmpC酶及超广谱β-内酰胺酶的研究

目的探讨临床分离的耐药性肠杆菌科细菌产AmpCβ-内酰胺酶(AmpC酶)和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的情况,为临床用药提供参考依据.方法采用纸片扩散确证试验检测ESBLs,三维试验法检测AmpC酶.结果207株肠杆菌科细菌中产ESBLs者95株(占45.9%),产AmpC酶者52株(占25.1%).结论 AmpC酶和ESBLs是导致肠杆菌科细菌耐药的两类主要酶.     

3种中药对产酶菌R质粒消除作用的研究

用煎煮法制备的黄芩、黄连和鱼腥草中药原液,在对产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌测定最小抑菌浓度的基础上进行了耐药质粒(R质粒)消除试验,并用美国国立临床实验室标准化委员会颁布的标准进行消除效果的判定。结果表明:黄芩、黄连和鱼腥草3种中药原液对2株产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌耐药质粒具有不同程度的消除作用,消除率分别达到15.27%、14.58%和6.25%及5.56%、0.00%和3.47%。