巢式PCR-HRM法在点突变模式小鼠基因分型中的应用

目的 利用巢式PCR结合高分辨率熔解曲线(HRM)技术，改进点突变模式小鼠的基因分型方法。方法 以ob/ob鼠和db/db鼠为样本，剪小鼠脚趾编号并提取基因组DNA。根据突变位点参考序列设计巢式PCR引物并进行两轮扩增后，对产物进行HRM分析，获得基因分型结果。同时，通过PCR-SBT法和PCR-RFLP法对分型结果的准确性进行验证。结果 对80只ob/ob鼠和65只db/db鼠进行了检测，巢式PCR-HRM法能够准确地分辨出3种基因型。在ob/ob鼠中，鉴定得到的纯合子、杂合子和野生型分别为21、47和12只。而在db/db鼠中，纯合子、杂合子和野生型分别为23、33和9只。巢式PCR-HRM法的分型结果与PCR-SBT法和PCR-RFLP法的结果高度一致，且分型结果与小鼠表型一致。结论 建立的巢式PCR-HRM法是一种快速、简便、准确度高的基因分型方案，适用于大批量点突变模式小鼠的基因分型鉴定。     

HSP70在肺癌组织中表达水平的研究

采用免疫组织化学ＳＡＢＣ法检测３９例肺部组织中ＨＳＰ７０的表达。结果显示：ＨＳＰ７０在高度分化的肺鳞癌和肺腺癌细胞中的阳性表达率与癌旁正常肺组织之间具有高度显著性差异（Ｐ〈０．０１）,ＨＳＰ７０的表达在高分化的肺鳞癌与肺腺癌之间则无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,在低分化的肺鳞癌和肺腺癌组织中,ＨＳＰ７０呈阴性反应,ＨＳＰ７０在肺癌组织中表达水平的高低与肺癌细胞的分化程度密切相关,而与肺癌的组织学类型     

iRhom2Uncv 小鼠乳腺发育障碍的转录组分析

摘要:目的 研究 iRhom2Uncv 小鼠乳腺表型相关的差异表达基因,为深入研究 iRhom2Uncv 小鼠乳腺发育障碍的相关机制提供靶点信息。 方法 对 12 周龄的野生型和 iRhom2Uncv 小鼠的乳腺组织进行 whole-mounts 染色,分析乳腺发育形态,收集乳腺组织进行转录组测序,筛选差异表达基因,ELISA 检测血清激素水平。 结果 与野生型小鼠相比,iRhom2Uncv 小鼠乳腺侧枝导管较稀疏,差异最显著的 18 个基因中有 6 个在 iRhom2Uncv 小鼠中表达上调,12 个表达下调。 其中 3 个催乳素家族基因在 iRhom2Uncv 小鼠中不表达,且在血清中几乎检测不到催乳素表达,而血清中的雌激素水平相比野生型小鼠较高。 结论 iRhom2Uncv 突变的小鼠存在乳腺发育障碍,可能与 iRhom2Uncv 小鼠中催乳素和 Zfp281 的缺失表达有关,生物信息学分析发现,iRhom2Uncv 小鼠神经发育可能存在不同于野生型小鼠的表型。     

硒酵母生理功能研究（Ⅱ）：对汞中毒小鼠体重及全血GSH—P …

对离乳雄性小白鼠进行不同饲喂实验，观察硒酵母对汞中毒小鼠体重及其全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性的影响，实验结果表明，汞显著抑制了小鼠全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性，仅为对照组的６０．４％，而同时给汞和硒酵母的小鼠ＧＳＨ－Ｐｘ。     

颗粒蛋白前体缺失型腹膜巨噬细胞的体外炎症应答

探讨颗粒蛋白前体缺失型巨噬细胞的体外炎症反应。选取野生型C57BL/6雄性小鼠6-8周(WT)和PGRN基因敲除雄性小鼠6-8周(KO)为实验动物。向小鼠腹腔内注射1m L6%的淀粉,脱颈法处死小鼠后提取腹膜细胞。用瑞士染色后油镜下观察细胞,用流式细胞仪进行细胞检测,显微镜下观察腹膜巨噬细胞吞噬功能,ELISA法检测腹膜巨噬细胞培养上清中TNF-a和IL-12因子。WT小鼠和PGRN基因敲除KO小鼠腹膜细胞的数目、形态和种类及巨细胞表面标志物和巨噬细胞吞噬功能均无显著性差异(p0.05)。PGRN基因敲除KO小鼠来源腹膜巨噬细胞培养上清中前炎性因子TNF-a和IL-12的含量较WT小鼠明显增高。PGRN对腹膜细胞的数目、形态、种类和巨噬细胞表面标志物没有显著影响,但会使巨噬细胞炎症反应增强。     

硒酵母生理功能研究(Ⅱ)──对汞中毒小鼠体重及全血 GSH-Px 活性的影响

对离乳雄性小白鼠进行不同饲喂实验,观察硒酵母对汞中毒小鼠体重及其全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性的影响．实验结果表明,汞显著抑制了小鼠全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性,仅为对照组的６０．４％,而同时给汞和硒酵母的小鼠ＧＳＨ－Ｐｘ活性不但没有降低,还比对照组提高了５０％以上,说明硒酵母对汞中毒引起的ＧＳＨ－Ｐｘ活性下降有显著的拮抗效应,这种效应在小鼠的生长和行为等方面也有同样的表现．     

清洁级小鼠感染嗜肺巴氏杆菌情况的初步调查

从１５只患结膜炎、肺炎的小鼠中分离出嗜肺巴氏杆菌１２株。随后对其群体中１０个品系８５只小鼠进行普查,结果感染率最高为ＣＢＡ及ＡＭＭＳ／１３小鼠,达２５％,ＡＢＬＢ／ｃ及ＡＭＭＳ／１也有检出,应引起生产者足够的重视。     

运用HSV－tk／ACV系统进行肿瘤基因治疗研究

构建了含ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ｐＬＮＴＫ，将ＨＳＶ－ｔｋ基因转移至人脑胶质瘤ＳＨＧ４４细胞（命名为ＳＨＧＬＮＴＫ）及小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６（命名为Ｂ１６ＬＮＴＫ）．体外实验证实核着类似物ＡＣＶ对ＳＨＧＬＮＴＫ细胞和Ｂ１６ＬＮＴＫ细胞的杀伤敏感性分别高于亲本细胞１０００和４００倍．转ＨＳＶ－ｔｋ基因细胞与亲本细胞按不同比例共培养时，亲本细胞对ＡＣＶ的敏感性明显增高，存在旁观者效应．首次应用人脑胶质瘤细胞株进行裸鼠体内实验，结果表明：ＡＣＶ能完全抑制ＳＨＧＬＮＴＫ细胞在裸小鼠体内肿瘤的形成，对裸小鼠体内已形成的ＳＨＧＬＮＴＫ肿瘤的治疗效果与对照ＳＨＧ４４肿瘤相比，肿瘤体积缩小８０％；用Ｂ１６ＬＮＴＫ细胞接种同系Ｃ５７／ＢＬ小鼠，经ＡＣＶ治疗后，Ｂ１６ＬＮＴＫ组小鼠的肿瘤较对照组Ｂ１６肿瘤小９５％．ＨＳＶ－ＴＫ／ＡＣＶ系统原位基因转移治疗ＳＨＧ荷瘤裸小鼠、Ｂ１６荷瘤小鼠，原位注射病毒悬液／ＡＣＶ治疗组的ＳＨＧ肿瘤、Ｂ１６肿瘤分别较对照组肿瘤小５０％，４３％，原位注射ＰＡ３１７／ＬＮＴＫ细胞，ＡＣＶ治疗的ＳＨＧ肿瘤较对照组肿瘤小９０％，以上实验结果，统计学上差异极显著，Ｐ＜０．０１．实验     

广西肝癌中HBV感染与N-ras基因突变的研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和免疫组化法检测２９例广西南部肝癌组织中的Ｎ－ｒａｓ基因突变和ＨＢＶ感染状况，结果，肝癌中Ｎ－ｒａｓ基因在第２￣３７密码子之间的突变率为７９．３％，其中２２例有２￣５个突变位点，该基因突变也见于癌旁组织，肝组织中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｓＡｇ和ＨＢｘＡｇ检出率分别为８６．２％和７９．３％，两者具有相关性，并与Ｎ－ｒａｓ基因突变率呈相平行的趋势。因广西南部的肝癌与ＡＦＢ１污染有关，本研究     

布鲁氏菌043强毒株BR0524基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价

为研究BR0524基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响,本研究利用同源重组的原理,以BR0524基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布鲁氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定之后进而获得羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株,且该缺失突变株在15代内未发生回复性突变,遗传性稳定。将羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株、羊种布鲁氏菌043和M5以106 CFU剂量腹腔接种小鼠,进行体内感染试验,并以布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为100∶1的感染比例侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7。结果表明:与羊种布鲁氏菌043相比,羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株的载菌量几乎没有下降(P0.05),对小鼠脾脏重量变化的影响也趋于相似(P0.05);侵染小鼠巨噬细胞试验结果与动物感染试验结果也趋于一致(P0.05),这表明BR0524基因的缺失不会对羊种布鲁氏菌043毒力功能的发挥产生显著的影响。     

小鼠巨噬细胞中microRNA-155促进急性心肌梗死后心室重构的作用机制

为探究巨噬细胞中microRNA-155(miR-155)表达水平对急性心肌梗死(AMI)后心室重构的影响及其机制,将miR-155基因过表达(miR-155+/+)和基因敲除(miR-155-/-)小鼠的骨髓细胞分别移植给野生型(WT)小鼠进行血液重建,并建立AMI模型,检测血浆及心肌组织中炎症因子TNF-α和IL-10的表达水平,评价小鼠心脏功能并观察巨噬细胞浸润、心室重构的情况,进而利用病毒包装技术敲降细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1)基因后验证其作为miR-155靶基因的影响.结果显示:miR-155+/+组较miR-155-/-组小鼠的心脏收缩功能显著受限(p0.01);巨噬细胞中miR-155表达水平显著影响血浆中炎症因子的释放(p0.01),并促进心室重构的发生(p0.01);miR-155表达水平与SOCS1的mRNA及蛋白质表达水平呈显著负相关(p0.01).综上可知,抑制AMI后巨噬细胞中miR-155的表达可以促进靶基因SOCS1的表达,从而减轻AMI后的炎症反应,有利于减轻心室重构.     

PD-1人源化小鼠构建繁殖与基因型鉴定

目的 探讨PD-1人源化小鼠的繁育与基因型鉴定，为进一步研究相关小分子抑制剂的体内药效评价提供动物模型。方法 通过构建PD-1人源化小鼠，获得F1代鼠4只，雌雄交配进行培育繁殖。对每窝仔鼠的数量，存活率等进行记录观察，随后对仔鼠剪尾提取基因组DNA,用PCR法扩增目的基因，然后进行核酸电泳，鉴定基因型。选用F2代纯合型与纯合型雌雄交配，野生型与野生型雌雄交配。结果 鉴定的F2代小鼠有野生型、纯合型和杂合型3种基因型。纯合型与纯合型交配获得F3代仔鼠基因型全部为纯合型。野生型与野生型交配获得F3代仔鼠基因型全部为野生型。结论 成功筛选出PD-1人源化小鼠纯合子基因型，并有效地进行扩群保种，为今后应用该小鼠模型提供实验保障。     

海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor, MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示：对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过...     

慢性肺部炎症合并肺炎支原体肺炎小鼠模型的建立

目的肺炎支原体肺炎(MPP)是肺炎支原体(MP)引起的以肺间质纤维结缔组织增生为主要病理改变的间质性肺炎。在临床易感于慢性肺部炎症病人,基于此原因本研究使用烟熏并肺炎支原体感染方法建立慢性肺部炎症合并肺炎支原体肺炎实验动物模型。方法本研究采用Realtime PCR、HE和Masson染色方法观察小鼠感染前后肺部肺炎支原体浓度、肺组织病变状况和肺组织胶原纤维生成情况。结果烟熏并感染组小鼠肺炎支原体感染率达到93%,肺泡腔塌陷,肺组织呈片状致密结构,内充斥大量红细胞,胶原纤维增多呈片状蓝染。结论通过实验可知烟熏并感染组小鼠肺内支原体浓度增高、肺组织病变情况严重,胶原纤维生成增多,预示慢性肺部炎症合并肺炎支原体间质性肺炎模型建立成功。     

水溶性壳聚糖对小鼠免疫功能与移植肿瘤的影响

研究了水溶性壳聚糖对小鼠非特异性免疫和体液免疫功能的影响，并对荷Ｓ１８０肿瘤的小鼠进行了抗肿瘤活性的初步观察。结果表明，水溶性壳聚糖能明显提高正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能，对绵羊红细胞诱导的血凝素抗体和溶血素的生成有显著影响，对小鼠Ｓ１８０肿瘤有明显的抑制作用，抑瘤率为５３．３％－６３．３％。     

果蝇醇脱氢酶S—139定点突变后活性的变化

经酶动力学分析，丝氨酸－１３９的突变体Ｓ１３９Ａ使ＤｍＡＤＨ完全失去催化活性。Ｓ１３９Ｃ和Ｓ１３９Ｔ使ＤｍＡＤＨ的催化能力分别下降为野生型的１４．３％和４１．６％以及４７％和７６％，而且Ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ａｌｃ）和ＣＡＴ（Ｋｍ（ＮＡＤ）差异极为显著；对于乙醇，突变体相对于野生型变化不大；而对于ＮＡＤ，突变体相对于野生型下降到原来的１０％以上。     

丙型肝炎病毒感染与ras,p53基因表达的相关性

为了探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染与肝细胞癌（ＨＣＣ）的关系以及ＨＣＶ可能的致癌机理，采用免疫组织化学方法及巢式ＰＣＲ法检测了１３６例肝细胞癌等肝病组织中的ＨＣＶＮＳ３抗原、ＨＣＶＲＮＡ及Ｐ２１、Ｐ５３蛋白。结果表明，肝细胞癌及癌周肝组织中有ＨＣＶＮＳ３抗原及ＨＣＶＲＮＡ检出，支持ＨＣＶ与ＨＣＣ的关联。Ｐ２１在ＨＣＣ、肝炎后肝硬化、慢性肝炎、体质性黄疸各组中的检出率随病变的加重而逐渐增高，在ＨＣＣ的癌及癌周组织中Ｐ２１呈致密的过量表达，提示ｒａｓ癌基因的激活在ＨＣＣ的发生过程中起一定作用。Ｐ５３的阳性率较Ｐ２１低，但ｐ５３的突变似乎也是肝癌发生的协同因素之一。组织中Ｐ２１的过量表达与ＨＣＶＮＳ３抗原阳性检出呈正相关，ＨＣＶＮＳ３抗原与Ｐ２１的这种关联提示，ＨＣＶ感染作为ＨＣＣ的密切相关因素之一，可能通过激活某些癌基因或使某些抑癌基因突变而致肝细胞癌变     

甘蓝型油菜短花序突变的同工酶与SSR分子标记

对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)短花序突变株系“M112”的不同时期野生型、突变体亲本及F1代不同器官的过氧化物同工酶（POD）进行遗传分析,并对随机选取的60株具有突变性状的苗期F2代群体的茎进行过氧化物同工酶（POD）分析.结果表明：野生型和突变体亲本在茎部POD 电泳图谱Rf 0.264处条带具有稳定的差异,所选的60株F2代群体中有56株的带型与突变体亲本相同,说明短花序突变性状与上述POD特征酶谱连锁紧密,并可以稳定遗传.同时选取F2代具有突变性状植株303株作为该突变基因的SSR分子标记分析群体,最终从分布于甘蓝型油菜19个连锁群的121个SSR标记中筛选到了标记Na12C06,标记与该突变位点连锁较紧密,遗传距离为9.8cM     

独活寄生汤调节淋巴系统防治类风湿关节炎

目的 探讨独活寄生汤(DHJST)对类风湿关节炎模型小鼠淋巴系统及免疫反应的影响。方法 采用随机数字表法将10只3月龄TNF-α转基因(TNF-Tg)小鼠随机分为模型组(TNF-Tg)和DHJST组(5只/组);5只野生型同窝小鼠作为正常对照。DHJST组采用独活寄生汤灌胃,模型组和正常对照组(Control)采用相同体积的生理盐水灌胃,1次/d,连续给药12周后取材。采用阿尔新蓝-苏木精(ABOG)染色观察骨量及滑膜炎症情况;免疫荧光染色,观察促炎M1型巨噬细胞、淋巴管新生以及分布情况。结果与模型组比较,DHJST组小鼠软骨侵蚀、骨侵蚀以及滑膜炎症情况明显改善(P<0.05),促炎M1型巨噬细胞数量减少(P<0.01),毛细淋巴管生成增加(P<0.01),集合淋巴管分布广(P<0.01)。结论 DHJST可通过调控淋巴系统,改善小鼠关节炎症情况,进而减缓类风湿关节炎进展。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。