水稻幼叶及幼穗cDNA文库的构建及初步分析

为了克隆水稻第6染色体上S5位点的基因及包括广亲和基因在内的重要功能基因,以水稻Oryza sativa L.广亲和品种Cpslo17为材料,以λTriplex2TM为载体利用SMART技术构建了幼叶和幼穗2种器官的cDNA噬菌体文库.幼叶和幼穗原始文库的克隆数目为别为1.5×105 pfu和2.45×105 pfu,插入片段的大小均在500～3 000 bp之间,文库的阳性克隆子的为别比例为97.0%和98.7%.此文库的建立为克隆广亲和基因和其它重要全长功能基因奠定了基础.     

中华卵索线虫cDNA文库的构建

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)是一种宝贵的昆虫天敌,宿主广泛,其寄生率即等于宿主的死亡率,生防潜力极大.鉴于cDNA文库在保存稀有物种基因资源与目的基因筛选及其功能研究等方面的优势,实验以中华卵索线虫为材料,采用SMART技术构建其cDNA文库.实验结果表明：滴度为1.16×109 cfu·mL－1,包含6.0×106个克隆.从原始文库中随机挑16个单菌落过夜培养,提取质粒,经XhoⅠ和 PstⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳结果表明插入片段大小主要集中在0.5～2.0 kb之间,文库重组率接近100%.文库的各项指标均达要求,可用于全长cDNA的筛选,为新基因的获得及其结构功能研究提供了可靠材料,也为今后的生物防治等研究奠定了基础.     

棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因,运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA,mRNA逆转录后合成cDNA,经均一化处理后,SfiⅠ酶切,连接质粒载体,电转化,成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL,其重组率高达94%,插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

小麦苗期盐胁迫72h cDNA文库的构建及质量检测

以98-160盐胁迫72 h叶片的mRNA为起始材料,采用SMART技术构建了一个高质量的cDNA文库,经检测,未扩增文库的滴度为3.44 ×106 pfu/mL,白斑率＞85%,插入片段多数在0.5～1.5kb,有的可以达到2kb,平均长度为800bp.因此,按照此方法构建的是1个高质量的cDNA文库,可有效地用于下一步全长基因的筛选和克隆.     

烟草腺毛全长cDNA文库的构建

冻刷法收集烟草品种K326腺毛组织,Trizol法提取总RNA,采用SMART技术构建了烟草腺毛的全长cDNA文库.经鉴定表明,文库滴度为1.01×106pfu/mL,重组率为99.5%.随机选择24个阳性克隆进行插入片段测序,结果显示,插入片段长度在800~1 000 bp之间,将测得的序列进行Unigene归并和序列全长分析,得到了23条Unigene,21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,完整性比率达到66.7%.结果表明,文库质量较好,可用于下一步基因克隆及基因表达谱的研究.     

海鲈头肾cDNA文库的构建

本文以海鲈头肾组织为材料,分离出mRNA,合成cDNA双链后,收集500-4000bpcDNA片段,构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的滴度为7×105pfu,随机挑选噬菌斑的插入片断在500~2000bp之间,证明建立的文库中所包含的重组cDNA分子种类具有一定的完整性,可作为海鲈头肾基因的重要资源。     

棉铃虫雌性成虫脂肪体cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍 酚 氯仿 步法从棉铃虫雌性成虫脂肪体中提取总RNA ,经过Oligo(dT)纤维柱分离出mRNA .以mRNA为模板 ,Oligo(dT)为引物 ,在逆转录酶催化下合成单链cDNA(sscDNA) .然后在E .coliDNA聚合酶Ⅰ与RNaseH共同作用下 ,进一步合成双链cDNA(dscDNA) .平末端dscDNA与EcoRI/NotI接头连接 ,插入λgt11表达载体 ,经体外包装后转染Y10 90 r 宿主菌 ,构建成棉铃虫脂肪体cDNA文库 .该文库的滴度为 3.5× 10 5pfu/mL ,重组率为 10 0 % ,该文库适合于筛选低丰度mRNA的cDNA克隆 .     

杨树黑斑病感抗无性系cDNA文库的构建

为了分离与抗病相关的目的基因,以病原菌接种后对黑斑病具免疫力的美洲黑杨I 69及黑斑病的高感无性系欧美杨I 45的叶片为材料,在利用荧光差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT PCR)获得抗病相关cDNA片段的基础上,用试剂盒及同样的植物材料构建了两个cDNA文库L45 72及L69 72。两文库的滴度分别为3.44×109pfu/mL及3.94×109pfu/mL,大于500bp的片段分别占96.67%和73.33%。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建与鉴定

利用λZAPExpress载体成功地构建了中国猪株旋毛虫分离株Trichinellaspiralis新生幼虫的cDNA文库 ,并对其重组噬菌体质粒pBK—CMV进行酶切鉴定 .结果表明 :所构建的cDNA文库容量为 1 92× 10 6,重组效率为 98 6 % ,所有的克隆片段都在 0 5— 2 0Kb之间 ,说明此cDNA文库几乎覆盖了全部mRNA .     

盐藻磷酸甘油脱氢酶基因cDNA文库的构建

采用Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０载体构建了盐藻ｃＤＮＡ文库，文库大小为１０＾６／ｍＬ插入片段平均长度大于１ｋｂ。根据果蝇，兔，鼠编码其３－磷酸甘油脱氢酶基因的辅酶ＮＡＤ的结合功能区保守序列设计一对引物，大小分别为２１ｂｐ和１８ｂｐ。ＰＣＲ扩增得到与果蝇相同的２９０ｂｐ特异扩增片段，以该片段为探针，采用缺口平移系统标记原位杂交，从盐藻ｃＤＮＡ文库中获得３６个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆。     

一种快捷有效的构建cDNA文库的方法

构建cDNA文库是研究基因组功能基因一种有效的手段，传统的建库方法通常需要在双链cDNA两端分别加上带限制性酶切位点的接头序列，通过酶切使之产生与质粒匹配的粘性末端，然后与质粒连接构成文库。本文介绍一种简单而且不需要核酸内切酶的构建cDNA文库的方法。该方法的主要步骤包括：（1）通过反转录合成cDNA第一条链，通过置换底物的方式在cDNA3’末端合成接头序列。（2）利用cDNA两端的接头引物，通过TaqDNA合成酶PER扩增合成cDNA第二条链。（3）将PCR产生的双链cDNA直接与T-载体连接。（4）将连接物转化大肠杆菌，得到cDNA文库。利用本方法，我们成功构建红树植物红海榄的cDNA文库。PCR结果显示插入的片段分布在O．5～3．0kb之间，大部分cDNA的长度在500—1000bp之间，表明cDNA具有较好的完整性。本方法具有操作简单、高效率、低成本、RNA模板需要量少的特点，而且适用于任何高等生物RNA样品。     

经大肠杆菌感染的中国家蚕cDNA文库的构建

用建立非表达文库的方法,从大肠杆菌感染后９ｈ的中国家蚕的ｍＲＮＡ合成ｃＤＮＡ片段,重组入噬菌体λｇｔ１０的ＥｃｏＲＩ的位点之间,所构成的基因非表达文库库容量为２×１０６重组子,经大肠杆菌Ｃ６００与Ｃ６００ｈｌｆ菌株平皿测定,重组率为７６％．     

麻疯树胚乳cDNA文库的构建与分析

以等质量比的不同发育阶段的麻疯树（Jatropha curcas L.）胚乳为材料构建麻疯树胚乳cDNA文库.初级文库滴度为1.5×106 Pfu/mL,重组率为99.7％,插入片段大小为0.4～4 kb,平均约1 kb.全长基因的比例达到20％.推测的蛋白质序列种类主要包括贮存蛋白相关、转录表达调控相关、脂肪酸合成相关及信号传导相关等同源基因序列.编码功能基因的类型与分布情况同Joseph A White等构建的蓖麻胚乳cDNA文库基本一致,个别类型如贮存蛋白合成相关基因的比例相比较低,信号传导     

杉木茎段形成层组织cDNA文库的构建

为了分离和克隆与杉木木材形成相关的重要基因,笔者以杉木2~3年生枝条,5~6月份形成层活动期的茎段形成层组织为材料,用表达型噬菌体载体ZAP构建了cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1-Blue,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。试验结果表明:初级文库的库容量达到6.1×105pfu,扩增文库的滴度达到5.2×109pfu/mL,重组率达到95%,插入片段大小在0.5~3.0 kb。     

人18周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

许多脑基因的特异性表达对人脑的发育，分化有着重要的作用，为了研究这些基因的结构和功能，构建了一个人１８周胎儿脑ＣＤＮＡ文库，抽提总ｍＲＮＡ后，经过一系列的酶促反应合成ｃＤＮＡ，分有分离柱除去小片段后克隆到λｇｔ１０载体中，转染宿主菌Ｃ６００ｊｆｌ后文库包装效率为４．６×１０＾６ｐｆｕ／μｇ，ｃＤＮＡ平均郫在于１．２ｋｂｐ已知序列设计引物，从ｃＤＮＡ文库中扩增出神经生长因子（ＮＧＦ）的生长编码基因