节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择

本实验利用实时荧光定量PCR对极大节选藻中16SrRNA、TEF(翻译延伸因子,GTPases)、RPL13(核糖体蛋白)、PSR(藻蓝蛋白β亚基)、CYP(亲环素家族)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、Hsp(热休克蛋白)和rpoD(RNA聚合酶σ70因子)八个候选基因在正常生长和持续光照条件下的稳定性进行了检测。用geNorm软件对实验数据进行处理,从中选出合适的内参基因。结果表明RPL13和CYP38可以作为正常生长和持续光照处理下极大节选藻节律性研究通用的内参基因16SrRNA基因的稳定性要低于其他的候选内参基因,并不是一个合适的内参基因。     

盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出蚕豆盐胁迫下不同组织中表达稳定的内参基因,本研究以不同浓度氯化钠胁迫下的蚕豆叶片、茎、根为材料,利用实时荧光定量PCR技术检测ELF1 A、ACT2、GAPA、18S rRNA、TUA和CYP2六个候选内参基因的表达情况;通过Ct值分析、及GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件综合分析候选...     

多氯联苯胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出多氯联苯(PCBs)胁迫下红树蚬(Polymesoda erosa)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)最适内参基因,为进一步开展分子毒理学研究奠定基础。【方法】以β?actin、18S rRNA、GAPDH和#?tubulin为候选内参基因,qRT-PCR测定PCBs胁迫下4个候选内参基因在红树蚬外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺组织中的表达水平,应用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析其表达稳定性。【结果】geNorm软件分析表明β?actin表达最稳定;NormFinder软件分析发现,外套膜、鳃和肝胰腺组织中β?actin的稳定性最好,闭壳肌组织中β?actin(0.454)表达稳定性略微低于#?tubulin(0.425),排第2位;BestKeeper软件分析表明,外套膜和鳃组织中β?actin最稳定,肝胰腺和闭壳肌组织中GAPDH最稳定,β?actin排位第2位。【结论】筛选β?actin为红树蚬在PCBs胁迫下的qRT-PCR最适内参基因。     

工业大麻种子萌发及渗透胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选适用于工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫下萌发的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)内参基因,研究以‘云麻7号’种子为试验材料,设置正常萌发和20%PEG渗透胁迫下萌发处理.利用qRT-PCR技术对10个候选参考基因（CDPK,e IF4E,TIP41,UBQ,EF1α,PP2A,Actin,Clathrin,TUB,DHS2）在3个萌发时间点（萌发3、5、7 d）幼苗中的表达量进行检测.通过GeNorm、Normfinder和BestKeeper三种软件包对内参基因表达稳定性进行评价,再利用RefFinder在线软件进行综合分析,从而获得稳定、适宜的内参基因.结果表明,在工业大麻种子正常萌发过程中,PP2A基因的稳定性最好.在渗透胁迫下的种子萌发中,UBQ基因的稳定性最好.综合两组结果得出,eIF4E内参基因的表达最稳定.研究结果确定了工业大麻种子萌发及渗透胁迫下进行qRT-PCR分析的最适内参基因,为今后研究工业大麻种子萌发响应渗透胁迫相关基因的表达提供前期基础.     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据,挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因;随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因,以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料,进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析,表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因,检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达,显示出一致的基因表达水平,进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因,同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。     

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.     

实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展

实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,已成为分子生物学和其它领域的重要技术工具。本文对实时荧光定量PCR技术的原理及其在食品、医学、环保领域的应用进行综述。     

应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法

介绍一种采用实时荧光定量PCR法鉴定重组细胞株基因组中外源基因拷贝数的方法.首先根据研究对象建立标准品,以拟检测的外源基因设计特定的引物,得出标准曲线,然后在不同重组细胞株中对外源基因进行Real-Time PCR鉴定,根据结果与标准品比对得出实际的拷贝数.结果表明:以转染sPDGFRα基因的重组CHO-K1细胞为例,采用该方法,利用标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系,并且具有较大的线性范围(101-105拷贝);测得各重组细胞株外源基因拷贝数不同,3次独立实验表明结果一致.与传统杂交技术鉴定转基因拷贝数相比,该方法具有高效省时、更稳定、高通量和低成本等优点.     

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计井合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ作为染料建立了实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quanfitative PCR）方法．以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0．999．溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃,结果表明：本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础．     

实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测中的应用研究进展

随着转基因食品的快速发展,转基因食品的大规模商业化引起了对安全性问题的广泛争议.为了对转基因食品作出综合的评价,建立灵敏、快速、准确、高通量的检测方法十分必要.本文综述了实时荧光定量PCR技术的基本原理、优缺点及其在转基因食品检测中的应用与研究进展,并探讨了该技术存在的问题和应用前景.     

人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

利用多重荧光定量PCR方法检测线粒体DNA拷贝数

为准确快速地检测出线粒体DNA拷贝数,建立新型多重荧光定量PCR(polymerase chain reaction)方案。该方案以高拷贝基因(300拷贝)替代以往单拷贝基因作为内参,减小线粒体拷贝数与内参基因拷贝数差异,同时,该方案在单管中检测线粒体和内参基因的拷贝数,消除了在不同管中检测内参基因和目的基因时的孔间差。此外考察了不同DNA抽提方法对线粒体DNA拷贝数检测结果的影响,并且构建质粒标准品(含有内参基因和线粒体DNA区段)。采用该方案检测100例中国人外周血样本线粒体DNA拷贝数,发现线粒体DNA拷贝数与年龄呈现负相关。该新型多重荧光定量PCR方案适用于大规模人群中线粒体DNA拷贝数的检测。     

实时荧光定量PCR检测疫霉侵染下辣椒ERF基因的差异表达

本研究利用real-time荧光定量PCR技术检测辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici.)胁迫下辣椒抗病基因ERF的mRNA转录水平变化.结果表明:与对照相比,疫霉侵染下辣椒ERF基因的表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低的变化特点,该基因在早期被诱导表达,在胁迫6h后表达量达到最大值,之后逐渐下降...     

实时荧光定量PCR法检测环境假单胞菌属细菌丰度

应用实时荧光定量PCR法,建立了总细菌及假单胞菌属的标准曲线,并以环境样本中假单胞菌属与总细菌的比值反映其细菌丰度.应用该方法评价人工除藻反应器中组合填料、无纺布、弹性填料等介质对太湖水中溶藻细菌之一的假单胞菌属的富集情况.结果显示:该方法对总细菌的检测范围为103~108个基因拷贝/μL(R2=0.997);假单胞菌属的检测范围为1~105个基因拷贝/μL(R2=0.994).对除藻反应器溶藻细菌富集效果的评价显示,所建立的方法能有效检测反应器中填料对该类溶藻细菌的富集程度.初步证明所建立的方法可有效定量假单胞菌属在环境样本中的丰度.     

鸭GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立鸭GAPDH基因的real-time PCR技术,为鸭功能基因mRNA水平的定量分析提供有用的方法学基础.根据GenBank中鸭GAPDH基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的real-time PCR方法.结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点.研究结果为鸭GAPDH作为内参基因用于鸭相关基因定量表达分析奠定了基础.     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用

实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是把酶动力学、核酸扩增与杂交、光谱分析和实时检测技术巧妙结合的一项技术；并且广泛应用于病毒学、遗传性疾病、肿瘤和癌症的诊断等方面．因此成为分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术研究进展及其应用做一综述．     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中hNTKL-BP1基因的表达

分别提取手术切除人原发性HCC肝癌和癌旁肝组织总RNA并逆转录为cDNA,在hNTKL-BP1基因的高保守区设计相应引物和Taqman荧光探针,实时检测PCR产物的荧光强度,采用2-△△Ct方法分析比较该基因在人类肝癌组织和癌旁肝组织中的表达差异.结果是44例原发性HCC肝癌组织中hNTKL-BP1基因表达水平显著高于癌旁肝组织(t=2.69,P<0.01),肝癌组织与癌旁肝组织hNTKL-BP1基因表达差异和肿瘤大小有一定的相关性(P=0.028),hNTKL-BP1基因可能与肝癌的发生、发展有一定相关性.     

废水处理功能菌株FA-2的实时荧光定量PCR检测

FA-2是油脂化工废水处理系统中分离到的降解脂肪酸和脂肪胺的功能菌.本研究以大肠杆菌为参照菌,基于荧光定量PCR技术,建立了检测FA-2相对含量的荧光定量PCR方法.根据FA-2已知特异序列GENE2和大肠杆菌16 s rRNA基因序列GENE1分别设计合成特异引物和Tagman探针,采用实时荧光定量PCR技术分别检测各样本FA-2和E.coli 16 s rRNA基因的相对拷贝数,获得了FA-2及大肠杆菌的标准曲线.并比较这两种基因剂量之比例和混和的菌数比例之间的关系.结果表明混合菌液中FA-2的含量与CtGENE2与CtGENE1的差值ΔCt呈线性关系,由此可以推算出模板DNA的数量及对应的细菌数量.荧光定量检测结果与直接计数结果基本一致.该方法的建立,为进一步在废水处理系统中应用FQ-CR检测功能菌的含量打下基础.